《Cells》：Non-Coding RNAs in Vascular Calcification: Regulatory Networks, Functional Diversity, and Therapeutic Insights
血管钙化是一种异位钙盐沉积过程，在慢性肾脏病、糖尿病和衰老等病理状态下缺乏有效治疗。本综述首次根据信号通路系统性地分类了参与血管钙化调控的miRNA，清晰揭示了不同通路（Wnt/β-catenin、BMP/Smad、NF-κB等）之间的调控节点和交叉对话，从而为精准靶向提供了通路水平的理论基础。同时，本综述剖析了miRNA的功能双重性和微环境依赖性——同一miRNA在不同情境下可发挥相反作用，表明基于miRNA的药物开发必须关注疾病选择性靶向递送，以避免功能逆转的风险。本文进一步全面总结了lncRNA的异质性调控模式、circRNA的独特调控方式，以及新兴非编码RNA（piRNA、tsRNA）参与的初步证据，并整合了循环非编码RNA作为非侵入性生物标志物的潜力及靶向治疗转化的前景。本综述提供了非编码RNA对血管钙化网络调控的全景视角，为精准诊断和多靶点联合干预奠定了理论基础。
2. Regulatory Roles of miRNA in Vascular Calcification
2.1. miRNAs Targeting the Wnt/β-Catenin Signaling Pathway
在Wnt/β-catenin信号通路调控网络中，多种miRNA通过靶向不同层次的分子参与血管和瓣膜钙化调控。例如，内皮细胞外泌体中的miR-302d-5p直接靶向抑制Wnt3配体，阻断经典Wnt/β-catenin信号通路，缓解血管平滑肌细胞（VSMC）钙化与衰老。miR-182-5p通过靶向抑制Dkk2，解除Krm1-Dkk2复合物对Wnt/β-catenin信号通路的负调控，促进瓣膜间质细胞（VIC）成骨分化。miR-378a-3p靶向抑制SULF1，阻断Wnt/β-catenin通路，抑制VSMC钙化。miR-26a靶向结缔组织生长因子（CTGF），调控OPG/RANKL信号通路，抑制VSMC钙化。miR-138-5p直接靶向RUNX2，阻断Wnt/β-catenin信号，抑制VIC成骨分化。miR-204-5p由AT2受体激动剂刺激的巨噬细胞外泌体递送至VSMC，靶向抑制RUNX2，缓解磷酸盐诱导的血管钙化。miR-433-3p在2型糖尿病血清中下调，解除其对Wnt/β-catenin和RANKL/RANK/OPG通路的抑制，间接促进钙化。
2.2. miRNAs Targeting the BMP/Smad/Runx2 Osteogenic Axis
2.2.1. miRNAs Targeting Runx2：多种miRNA通过直接靶向成骨转录因子Runx2发挥抑制作用。miR-211在高磷酸盐环境中下调，减弱对Runx2的抑制，促进VSMC成骨分化。miR-204因DNMT3a介导的启动子高甲基化而下调，过表达miR-204可靶向Runx2逆转钙化，形成miR-204/DNMT3a负反馈环。miR-205靶向Runx2和Smad1，负调控成骨样分化。miR-133a在BMP2诱导的VSMC钙化模型中下调，过表达降低Runx2和骨钙素水平。miR-30家族（miR-30b、miR-30c）直接结合Runx2 mRNA抑制翻译，在钙化冠状动脉中水平降低。miR-335通过骨髓间充质干细胞外泌体递送至VSMC，靶向SP1下调RUNX2，拮抗成骨分化。相反，miR-3960和miR-2861在VSMC成骨转分化中上调，分别靶向抑制Hoxa2和HDAC5，增加Runx2蛋白水平，形成正反馈促进钙化。
2.2.2. miRNAs Targeting BMP/Smad or Related Molecules：沿BMP/Smad通路上下游，多种miRNA靶向不同节点。上游水平，高糖条件下巨噬细胞来源的细胞外囊泡递送miR-17-5p，靶向抑制转化生长因子-β受体II（TGF-βRII），减弱TGF-β1诱导的VSMC成骨分化。miR-302b在慢性肾衰竭大鼠血管钙化模型中下调，过表达通过抑制BMP-2/Runx2/Osterix信号通路缓解钙化。miR-103a-3p在主动脉瓣狭窄患者血浆细胞外囊泡中下调，过表达通过调控BMP4/RUNX2轴抑制VIC成骨分化。miR-455-3p在同一疾病中上调，抑制其表达可缓解VIC钙化。miR-26b靶向抑制Smad1，阻断成纤维细胞来源的BMP4介导的促钙化通讯。miR-145-5p直接结合抑制Smad3表达，阻止VSMC成骨分化。miR-449c-5p在钙化人主动脉瓣中显著下调，过表达靶向抑制Smad4，阻断TGF-β/Smad信号通路。miR-125b靶向SP7负调控VSMC成骨分化。miR-638在钙化主动脉瓣中上调，靶向SP7发挥抗成骨作用，可能为代偿性保护反应。miR-101-3p在钙化人主动脉瓣中上调，通过靶向抑制CDH11和SOX9促进VIC成骨分化。
2.3. miRNAs Targeting the NF-κB Inflammatory Signaling Pathway
在NF-κB炎症信号通路中，miR-138直接结合抑制TLR3 mRNA，阻断下游NF-κB信号，抑制血管钙化。miR-155-5p在尿毒症毒素硫酸吲哚酚（IS）诱导下通过ROS/NF-κB通路上调，靶向抑制MGP促进钙化。miR-223-3p靶向抑制STAT3，阻断IL-6/STAT3信号通路，防止VSMC向成骨样表型转化，对中膜钙化和动脉粥样硬化钙化发挥双重保护作用。miR-29b在钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）中上调，靶向抑制STAT3，下调SOCS1表达，激活NLRP3炎症小体介导的焦亡，促进VIC成骨分化。miR-34a靶向抑制SIRT6，削弱Keap1/NRF2介导的抗氧化防御，促进生理性衰老诱导的动脉中膜钙化；利拉鲁肽通过下调miR-34a逆转钙化。
2.4. miRNAs Targeting the MAPK and PI3K/AKT Signaling Pathways
在MAPK和PI3K/AKT信号通路中，miR-195在CAVD中下调，上调miR-195通过靶向抑制VWF并阻断p38-MAPK信号通路，减轻VIC成骨分化。miR-30e在正常血管中高表达，通过抑制IGF2抑制成骨分化；在衰老和动脉粥样硬化条件下，miR-30e下调导致IGF2表达增加，促进钙化。miR-29a-3p靶向抑制Vegfa表达，缓解VSMC钙化。CKD患者循环小细胞外囊泡中miR-16-5p、miR-17-5p、miR-20a-5p和miR-106b-5p协同缺失，共同解除对VEGFA-VEGFR2轴的抑制，驱动VSMC成骨转化。miR-670-3p在高磷酸盐诱导的内皮细胞外泌体中富集，被VSMC摄取后靶向抑制IGF-1，促进成骨分化。miR-32在2型糖尿病相关血管钙化患者血浆中升高，促进内皮细胞铁死亡；骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡通过抑制miR-32介导的铁死亡和调控FoxO/MAPK通路缓解钙化。miR-22在钙化人主动脉瓣中上调，直接靶向抑制CAB39，削弱AMPK-mTOR信号通路，促进VIC成骨分化。
2.5. miRNAs Targeting the Endoplasmic Reticulum (ER) Stress and Autophagy Pathways
在内质网应激和自噬通路中，miR-199a-5p在CAVD中显著下调，过表达直接靶向抑制ATF6和GRP78，阻断该支路激活，抑制VIC成骨分化。miR-4731-5p在β-甘油磷酸诱导的VSMC钙化中下调，过表达抑制PERK/ATF4介导的内质网应激，减轻成骨样表型转化。间歇性缺氧刺激的VSMC来源外泌体中的miR-129和miR-342协同靶向抑制eIF2α/ATF4信号轴，减弱VIC成骨分化。miR-214在钙化主动脉瓣组织中下调，过表达直接靶向抑制ATF4和Sp7，抑制VIC成骨分化。冷暴露诱导的血浆外泌体富集miR-320a-3p，通过靶向抑制PDCD4激活AMPK/mTOR自噬通路，抑制VSMC成骨分化。相反，miR-181c-5p在CKD相关血管钙化中上调，靶向抑制SIRT1，抑制Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，促进铁死亡，驱动VSMC成骨样分化。
2.6. miRNAs Targeting the Notch Signaling Pathway
在Notch信号通路中，miR-29a-5p在CKD中因甲状旁腺激素下调，解除对靶基因GSAP的抑制，激活γ-分泌酶/Notch1信号通路，诱导瓣膜内皮-间充质转化，促进瓣膜钙化。miR-34b通过靶向抑制Notch1，抑制VSMC向成骨样细胞分化，在高磷酸盐条件下miR-34b表达受抑制，与钙化程度负相关。
2.7. miRNAs Targeting the Extracellular Matrix and Calcification Inhibitors
在细胞外基质和钙化抑制剂调控网络中，miR-29b-3p直接靶向抑制基质金属蛋白酶2（MMP2），抑制血管钙化。miR-874-3p直接靶向抑制抗钙化基因Adam19，促进钙化。miR-143-3p靶向抑制基质Gla蛋白（MGP），促进钙化；在高糖条件下，MALAT1在巨噬细胞外泌体中海绵化miR-143-3p，解除对MGP的抑制，减弱VSMC钙化。miR-181b在振荡剪切应力下于瓣膜纤维层内皮细胞中上调，靶向抑制TIMP3，增强基质金属蛋白酶活性，促进细胞外基质降解，参与CAVD早期病理重塑。
2.8. Circulating miRNAs as Potential Biomarkers
在CKD、终末期肾病（ESRD）和透析相关血管钙化中，多种循环miRNA下调，可作为潜在生物标志物，包括miR-106a-5p、miR-223-3p、miR-93-5p、miR-211-5p、miR-31-5p、miR-125b、miR-143-5p、miR-145和miR-486。在动脉钙化患者中，循环miR-126-3p和miR-145-5p显著下调，低miR-126-3p表达预测主要不良心血管事件。在CAVD中，血清miR-17-5p和miR-29a-3p下调，低基线血浆miR-223表达与经导管主动脉瓣植入术后不良事件风险增加相关，miR-210上调与死亡率独立相关，miR-92a在二叶式主动脉瓣中高表达并与跨瓣压差正相关。当前研究存在队列规模小、缺乏独立验证、标准化方案缺失等局限性。
2.9. Context-Dependent miRNAs (Functional Duality)
miRNA的功能双重性源于其通过种子序列互补性调控多个靶基因的能力，以及靶基因表达、信号通路活性和细胞微环境的差异。miR-21-5p在CAVD中靶向TGFBI促进VIC成骨分化，在CKD中通过外泌体递送靶向Crim1促进VSMC钙化，在糖尿病中靶向Tpm1促进钙化。miR-155-5p在正常条件下靶向RCN2发挥抗钙化作用，在高磷酸盐条件下因RCN2/STAT3轴负调控而下调，在尿毒症毒素IS诱导下通过ROS/NF-κB通路上调并靶向MGP促进钙化，在人外周动脉钙化病变中上调并促进VSMC成骨分化。miR-145-5p在血管中靶向抑制Smad3抑制钙化，但在CAVD中通过细胞外囊泡递送靶向ZEB2上调ALPL促进VIC钙化。
3. Regulatory Mechanisms and Functional Heterogeneity of lncRNAs
3.1. lncRNAs That Inhibit Vascular Calcification
3.1.1. ceRNA (miRNA Sponging) Class of Anti-Calcific lncRNAs：lncRNA HOTAIR通过海绵化miR-126上调Klotho表达，激活SIRT1并阻断Wnt/β-catenin信号通路，减弱钙化。lncRNA GAS5通过海绵化miR-26b-5p上调PTEN，抑制成骨分化。lncRNA SNHG29通过海绵化miR-200b-3p激活α-Klotho/FGFR1/FGF23轴，抑制钙化。lncRNA OIP5-AS1通过海绵化miR-137上调TWIST1，保护VIC免于成骨分化。lncRNA FGD5-AS1通过海绵化miR-497-5p上调BIRC5，抑制VIC成骨分化。
3.1.2. Direct Protein-Binding and Epigenetic Regulation Class：lncRNA SNHG1通过稳定Bhlhe40 mRNA并促进其SUMO化和核转位，抑制自噬关键基因Atg10，缓解高糖诱导的VSMC钙化。lncRNA HOTAIR由E2F1转录激活，作为分子支架招募KDM1A和EZH2，表观遗传沉默KLF16，解除对Klotho的转录抑制。
3.1.3. lncRNAs That Inhibit Osteogenic Signaling Pathways：lncRNA Lrrc75a-as1通过抑制成骨标志物Runx2、Msx2和BMP2的表达，缓解钙沉积。lncRNA-EPS通过抑制炎症反应和阻断Wnt/β-catenin信号通路，改善糖尿病相关血管钙化。
3.2. lncRNAs That Promote Vascular Calcification
3.2.1. ceRNA (miRNA Sponging) Class of Pro-Calcific lncRNAs：lncRNA NEAT1通过海绵化miR-214-3p上调PTEN，抑制PI3K/AKT/mTOR通路，促进VIC成骨分化。lncRNA TUG1通过海绵化miR-204-5p上调Runx2，促进VIC成骨分化。lncRNA MALAT1通过海绵化miR-30c上调Runx2，促进VSMC钙化。lncRNA Prrc2c通过海绵化miR-145-5p上调Smad3，促进钙化。lncRNA SENCR通过海绵化miR-4731-5p激活PERK/ATF4介导的内质网应激，上调Runx2。
3.2.2. Epigenetic and Transcriptional Regulation Class：lncRNA NEAT1直接结合EZH2，促进其核转位，抑制衰老和迁移相关基因（P16、P21、TIMP3）转录，增强VSMC增殖、迁移和成骨分化。lncRNA SNHG3与EZH2相互作用，抑制BMP2启动子区H3K27三甲基化，上调BMP2表达，促进VIC成骨分化。
3.2.3. Signaling Pathway, Inflammation, and Phenotypic Transformation Class：lncRNA MEG3激活Wnt/β-catenin信号通路，促进VIC成骨分化。lnc-COL6A1-6通过抑制自噬活性促进VIC成骨分化。lncRNA AFAP1-AS1促进M1巨噬细胞极化，抑制M2极化，加剧VIC成骨分化。lncRNA FAS-AS1通过降低活性氧水平和抑制肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-6，缓解氧化应激和炎症，抑制VSMC钙化。lincRNA-p21通过小细胞外囊泡介导的促钙化信号，促进VSMC成骨转分化、凋亡和钙沉积。lncRNA ANRIL以细胞自主方式驱动VSMC向骨软骨样状态转化，促进动脉钙化。
3.2.4. Context-Dependent lncRNAs：lncRNA H19在CKD相关高磷酸盐环境中作为miR-138的海绵，激活NF-κB信号通路，加剧钙化；在糖尿病模型中通过抑制BI-1/OPA1蛋白通路，增强钙沉积；在高磷酸盐诱导下因启动子CpG岛低甲基化而上调，通过激活Erk1/2通路促进成骨分化。
4. Unique Regulatory Modes of circRNAs
circRNA通过多种机制发挥抑制或促进作用。在抑制方面，circSmoc1-2通过海绵化miR-874-3p间接上调Adam19，抑制VSMC钙化。circZBTB44通过m6A修饰翻译新型肽段ZBTB44-342aa，结合IGF2BP3稳定CAMK1，抑制线粒体损伤和mtDNA泄漏，阻断cGAS-STING通路激活，缓解VIC成骨分化。circHIPK3通过DDX5/METTL3介导的m6A修饰招募IGF2BP2稳定Krm1 mRNA，增强Krm1-Dkk2复合物对Wnt/β-catenin通路的抑制，拮抗VIC成骨分化。circSMAD3作为分子支架增强hnRNPA1与E3泛素连接酶WDR76的相互作用，促进hnRNPA1泛素化降解，调控p53 pre-mRNA剪接，激活p53γ信号通路，抑制VSMC增殖和表型转换。在促进方面，circ-GALK2通过海绵化miR-134-3p上调CD36，促进VSMC成骨分化。circTOP1通过靶向调控PTBP1表达，促进VSMC向成骨样表型转化。circ_0008362在高糖诱导的内皮细胞来源细胞外囊泡中富集，既海绵化miR-1251-5p上调Runx2，又直接与Runx2蛋白相互作用，协同促进VSMC成骨分化。circARHGAP10通过海绵化miR-335-3p上调RUNX2，驱动VIC成骨分化。circ-CCND1通过海绵化miR-138-5p上调CCND1，激活CCND1/P53/P21信号通路，促进VIC钙沉积。CircRIC3通过海绵化miR-204-5p上调DPP4，促进VIC成骨分化；褪黑素通过下调该轴缓解钙化。
5. Other Novel Non-Coding RNAs Associated with Calcification
新型非编码RNA如PIWI相互作用RNA（piRNA）和tRNA衍生小RNA（tsRNA）参与钙化调控。在主动脉瓣钙化中，AVCAPIR显著上调，直接结合并抑制FTO的m6A去甲基化酶活性，增强CD36 mRNA的m6A修饰和IGF2BP1依赖性稳定性，上调CD36/PCSK9信号轴，促进VIC成骨分化。tsRNA-5006c在M1巨噬细胞来源细胞外囊泡中富集，被VIC摄取后通过增强线粒体自噬，促进成骨分化和钙化。
6. Discussion
6.1. Microenvironment-Dependent Regulatory Mechanisms of Non-Coding RNA Functional Duality
非编码RNA功能双重性的根源在于细胞微环境和靶基因库的差异。miR-21-5p在CAVD中靶向TGFBI，在CKD中通过外泌体靶向Crim1，在糖尿病中靶向Tpm1，均发挥促钙化作用。miR-155-5p在尿毒症毒素诱导下通过ROS/NF-κB通路上调靶向MGP促进钙化，在外周动脉钙化中也表现出促钙化效应。miR-145-5p在血管中靶向Smad3抑制钙化，在瓣膜中靶向ZEB2促进钙化。lncRNA H19在不同环境中激活NF-κB、Erk1/2或抑制BI-1/OPA1等不同下游通路。这些异质性表明同一非编码RNA可通过不同“RNA-靶基因-信号通路”模块发挥相反效应，RNA治疗药物开发需考虑疾病选择性靶向递送以避免功能逆转风险。当前研究缺乏跨模型系统验证，部分矛盾结论可能源于实验系统差异。
6.2. Targeted Intervention Strategies Against Pro-Calcific Non-Coding RNAs
靶向抑制促钙化非编码RNA或挽救其下游通路可改善血管钙化。褪黑素通过下调CircRIC3/miR-204-5p/DPP4轴缓解VIC成骨分化；利拉鲁肽通过下调miR-34a恢复SIRT6/NRF2抗氧化通路，逆转衰老相关中膜钙化；丹连通脉方联合间歇性禁食通过抑制miR-21-5p/Tpm1轴发挥抗糖尿病血管钙化作用。反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）靶向促钙化lncRNA（如NEAT1、MALAT1）或circRNA，以及脂质纳米颗粒（LNP）或细胞外囊泡封装抗钙化miRNA，有望实现精准抑制。
6.3. Clinical Translation Prospects of Protective Non-Coding RNA Replacement Therapy
保护性miRNA如miR-133a通过抑制Runx2和骨钙素缓解VSMC钙化，循环miR-133a水平可预测主动脉瓣置换术后左心室肥厚的可逆性。近期研究利用基因工程细胞外囊泡表面展示羟基磷灰石结合肽，实现miR-133a向钙化血管的靶向递送，有效减少动脉粥样硬化小鼠模型中的血管钙化。siRNA药物inclisiran在心血管领域的临床转化突破为开发保护性miRNA模拟物提供了重要参考。未来挑战在于提高靶向效率、延长半衰期、降低免疫原性，并根据钙化类型选择最优递送策略。
6.4. Non-Coding RNA Co-Regulatory Networks and Multi-Target Combination Intervention Strategies
非编码RNA的协同调控网络为多靶点联合干预提供理论基础。CKD患者循环小细胞外囊泡中miR-17-5p、miR-20a-5p和miR-106b-5p协同缺失，共同解除对VEGFA-VEGFR2轴的抑制；在Klotho缺乏环境中，miR-135a、miR-762、miR-714和miR-712协同上调，同时抑制多种钙外排蛋白导致钙超载。单一RNA干预可能因代偿机制而效果有限，未来需采用多靶点组合策略，如同时使用多种保护性miRNA模拟物、联合靶向不同促钙化通路的siRNA/ASO，或开发可同时调控多个miRNA的环状RNA“超级海绵”。非编码RNA与常规药物（如磷酸盐结合剂、SGLT2抑制剂）的联合也可能发挥协同保护作用。
6.5. Safety Considerations and Off-Target Effects in ncRNA Therapeutics
非编码RNA治疗（包括抑制剂和替代疗法）存在脱靶效应的固有风险。寡核苷酸治疗可通过部分种子序列互补性影响多个转录本，可能破坏非靶组织中的基因调控网络。例如，系统抑制miR-21治疗血管钙化可能意外促进肿瘤发生或加重心脏重塑。缓解策略包括组织特异性递送系统（如配体偶联脂质纳米颗粒）、局部给药途径（如血管周围或冠状动脉内给药），以及化学修饰（如2′-O-甲基、锁核酸、硫代磷酸酯骨架）增强靶特异性并降低免疫刺激。临床前安全性药理学研究应包含全面的毒理基因组学分析，临床试验需严格监测免疫激活、肝毒性和血液学异常相关不良事件。
6.6. High-Priority ncRNAs for Therapeutic and Diagnostic Development
基于证据强度（人类/动物验证）、病理广度和机制独特性，8种非编码RNA被列为高优先级候选分子。miR-21-5p在CAVD、CKD和糖尿病中通过不同靶点发挥促钙化作用，抑制其活性具有治疗潜力。miR-133a是经典抗钙化miRNA，通过下调Runx2和骨钙素缓解VSMC钙化，循环水平可预测瓣膜置换后左心室肥厚可逆性。miR-204-5p在VSMC和VIC中通过靶向Runx2发挥一致抗钙化作用。miR-223-3p通过靶向STAT3对中膜和动脉粥样硬化钙化发挥双重保护，并可作为循环生物标志物。circ_0008362通过海绵化miR-1251-5p和直接结合Runx2的双重机制促进钙化，其血浆水平与糖尿病患者钙化严重程度相关。NEAT1通过ceRNA和EZH2介导的表观遗传机制促进钙化，是ASO靶向的优选分子。H19在CKD、糖尿病和高磷酸盐环境中通过不同通路（NF-κB、BI-1/OPA1、Erk1/2）发挥促钙化作用。circZBTB44编码肽段抑制cGAS-STING信号，为肽类治疗开辟新途径。
6.7. Functional Hierarchy of ncRNA Regulation: Genuine Drivers or Downstream Manifestations?
非编码RNA-靶轴是血管钙化的真正限速驱动因素，还是更广泛表观遗传和转录重编程的下游表现？现有证据表明两者并存。部分ncRNA如NEAT1直接结合EZH2并促进其核转位，表观遗传沉默P16、P21和TIMP3，驱动VSMC增殖和成骨分化；HOTAIR由E2F1转录激活，作为支架招募KDM1A和EZH2，导致KLF16表观遗传沉默和Klotho去抑制，这些赋予了ncRNA“驱动”特征。另一方面，许多靶向Runx2和Smad通路的ncRNA-靶相互作用可能位于中间网络层，Runx2本身受多级调控，是多个上游信号的读出器而非独立开关。因此，汇聚于Runx2或Smad的ncRNA可能作为信号放大器或微调器，而非钙化自主启动子。若大多数ncRNA-靶相互作用位于表观遗传重编程的下游，单一ncRNA靶向可能不足以逆转已建立的钙化，除非同时处理上游驱动因素。当前研究多局限于单一ncRNA-靶轴的线性描述，缺乏功能层级系统分析，该问题有待未来探究。
