《Cells》：Plateau Hypoxia Influences Mouse Circadian Behavior by Remodeling the Hypothalamic Transcriptional Landscape
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摘要：背景：低氧信号与昼夜节律钟之间存在广泛的分子串扰，但内源性昼夜节律时序如何影响高海拔暴露期间的行为反应，仍未得到充分阐明。方法：将雄性 C57BL/6J 小鼠暴露于相当于海拔 6000 m 的低压低氧环境。于 12 h 光照/12 h 黑暗（LD）循环及
摘要：背景：低氧信号与昼夜节律钟之间存在广泛的分子串扰，但内源性昼夜节律时序如何影响高海拔暴露期间的行为反应，仍未得到充分阐明。方法：将雄性 C57BL/6J 小鼠暴露于相当于海拔 6000 m 的低压低氧环境。于 12 h 光照/12 h 黑暗（LD）循环及恒暗条件下连续监测跑轮活动，以评估自主活动、节律振幅、昼夜节律相位及自由运行周期。暴露 48 h 后，于昼夜节律周期的多个时点采集全下丘脑样本，进行时间序列 RNA 测序、节律性分析、通路富集分析及实时定量聚合酶链式反应（qPCR）验证。在另一项实验中，分别于授时因子时间 ZT2 或 ZT14 开始低氧暴露，以评估依赖昼夜节律相位的行为反应。结果：高海拔暴露急性降低了自主活动与节律振幅，随后在 LD 循环下导致行为昼夜节律相位延迟，而恒暗条件下的自由运行周期未发生改变。转录组分析显示，全下丘脑节律性基因表达发生广泛重塑，涉及多条信号转导与代谢通路。松弛素（relaxin）相关信号通路被识别为与低氧诱导的时序性转录重塑相关的候选通路，且部分核心时钟基因及松弛素通路相关基因表现出改变的时间表达谱。此外，于 ZT14 开始的暴露较于 ZT2 开始的暴露引起更显著的自主活动抑制。结论：高海拔暴露可扰乱行为性昼夜节律组织，并重塑下丘脑节律性转录。上述发现提示，内源性昼夜节律时序可调节机体对低氧应激的行为敏感性。
该论文发表于《Cells》，围绕高原低氧暴露对昼夜节律系统的影响展开，重点关注行为节律改变及其下丘脑转录基础。昼夜节律是由内源性生物钟驱动的近 24 h 周期振荡系统，广泛调控睡眠/觉醒、运动活动、体温、摄食、能量代谢和神经内分泌功能。哺乳动物中，核心分子机制主要依赖转录-翻译反馈环路（TTFL，转录-翻译反馈回路），由 CLOCK/BMAL1 激活 Period 和 Cryptochrome 等基因表达，其蛋白产物再反向抑制 CLOCK/BMAL1 依赖性转录。下丘脑不仅包含作为中央起搏器的视交叉上核（SCN，suprachiasmatic nucleus），还整合觉醒、摄食、自主神经调控、体温调节及应激适应等多方面功能，因此是环境应激与昼夜节律耦联的重要中枢。
现有研究表明，低氧信号与昼夜节律钟之间存在双向调控关系。氧供变化可通过低氧诱导因子相关机制影响分子时钟，而核心时钟组分也可反过来调节低氧反应转录程序。高海拔暴露会持续降低氧可用性，并引起体力下降、疲劳、睡眠紊乱、体温调节异常、认知受损及能量代谢变化。这些过程本身均受昼夜节律调控。然而，持续性低压低氧究竟主要影响行为节律的相位、振幅还是内在周期，以及内源性昼夜节律状态是否会改变机体对高原低氧的行为反应，仍缺乏系统证据。基于此，研究人员开展本研究，旨在从行为学和时间转录组两个层面揭示高原低氧对小鼠昼夜节律系统的影响。
研究人员采用雄性 C57BL/6J 小鼠，在模拟海拔 6000 m 的低压低氧条件下，连续监测跑轮活动，并结合恒暗实验判断低氧对自由运行周期的影响。同时，在暴露 48 h 后按昼夜时序采集全下丘脑样本，分析节律性转录变化，并进一步比较在 ZT2 与 ZT14 启动低氧暴露时小鼠运动反应的差异。研究结果显示，高海拔暴露可急性抑制自主活动并降低节律振幅，在 LD 循环下造成行为昼夜节律相位延迟，但并不显著改变自由运行周期；与此同时，全下丘脑节律性转录图谱发生广泛重构，松弛素相关信号通路成为与低氧诱导转录时序重塑相关的候选通路；此外，活动期早期即 ZT14 开始暴露所致运动抑制强于静息期 ZT2。该研究的重要意义在于，首次较系统地将高原低氧、昼夜节律相位和下丘脑节律性转录重塑联系起来，为高海拔暴露、适应及低氧训练中的“时间因素”提供了实验依据。
就主要技术方法而言，研究采用跑轮行为监测结合 Clocklab 系统分析小鼠在 LD 与 DD 条件下的活动总量、节律振幅、相位与自由运行周期；采用全下丘脑时间序列 RNA 测序（取样时点为 ZT0、ZT6、ZT12、ZT18、ZT24；每个处理-时间点含 3 只独立生物学重复），并用 MetaCycle 中 JTK 算法进行 24 h 固定周期节律性判定、DESeq2 进行差异表达分析、clusterProfiler 进行 KEGG 通路富集分析；最后使用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）对核心时钟基因和松弛素通路相关基因的时间表达谱进行验证。另设置 ZT2 与 ZT14 两种暴露起始时相的行为实验以评估时相依赖性效应。
3.1. High-Altitude Exposure Alters Locomotor Circadian Rhythms in Mice
研究人员首先在 LD 循环下评估高海拔暴露对小鼠运动昼夜节律的影响。结果显示，暴露开始第 1 天，小鼠跑轮活动总量及节律振幅即明显下降，提示低压低氧对运动输出具有急性抑制作用。自第 2 天起，活动量和振幅虽有逐步恢复，但暴露期间仍保持异常。更重要的是，跑轮活动相位自暴露后第 2 天开始出现延迟，并在 LD 条件下持续至少 3 d。随后在恒暗（DD）条件下测定自由运行周期，结果未见常氧组与高海拔暴露组之间存在显著差异。由此说明，高原低氧主要导致行为节律输出的急性抑制与相位延迟，而未检测到内源性节律振荡器速度即自由运行周期的明显改变。
3.2. High-Altitude Exposure Remodels Rhythmic Gene Expression in the Whole Hypothalamus
为探讨行为相位延迟的转录基础，研究人员在暴露 48 h 后按 6 h 间隔采集全下丘脑样本并开展时间序列转录组分析。数据共检测到 21,349 个表达基因，不同授时因子时间点上的上调、下调及总差异表达基因数量存在明显差异，说明下丘脑对低氧的转录应答具有显著时间依赖性。进一步节律性分析显示，仅在常氧条件下满足节律性标准的基因为 3493 个，仅在高海拔暴露条件下满足节律性标准的基因为 783 个，而两种条件下共同具有节律性的基因为 124 个。该结果表明，高原低氧并非简单削弱全部节律性转录，而是显著重组下丘脑节律性基因表达结构。KEGG 富集结果显示，常氧特异节律基因主要富集于 MAPK 信号通路、细胞黏附分子、Hippo 信号通路、细胞凋亡及尼古丁成瘾相关通路；低氧特异节律基因则富集于马达蛋白、内吞作用、松弛素信号通路、mTOR 信号通路和昼夜节律通路；两条件共有节律基因富集于昼夜节律、钙信号及若干疾病相关通路。由此可见，高原低氧显著重塑了全下丘脑的节律性转录景观，并提示多条候选分子通路参与这一过程。
3.3. High-Altitude Exposure Alters the Temporal Expression of Core Clock and Relaxin Pathway-Associated Genes
在低氧特异节律通路中，研究人员选择松弛素信号通路作进一步探索。RNA-seq 结果显示，Egfr、Prkca、Mmp2、Creb3、Col1a1、Col1a2 和 Col3a1 等 7 个通路相关基因在常氧与高海拔暴露之间具有不同的时间表达模式。qPCR 验证进一步证明，高海拔暴露改变了核心时钟基因 Bmal1、Per1、Per2、Cry1 和 Cry2 的 24 h 表达谱，同时也改变了所选松弛素通路相关基因的时间表达特征，其中 Egfr、Mmp2、Col1a2 和 Col3a1 的差异尤为显著。该部分结果说明，高原低氧伴随着核心时钟分子网络与松弛素相关分子程序的协同时间重排。不过，作者同时明确指出，现有证据仅支持相关性，尚不能证明松弛素信号通路在低氧诱导行为相位变化中的因果作用。
3.4. Circadian Timing Modulates the Locomotor Response to High-Altitude Exposure
为判断行为反应是否依赖昼夜节律相位，研究人员分别在 ZT2 和 ZT14 启动低压低氧暴露。结果显示，两组小鼠在暴露开始后跑轮活动均明显下降，但 ZT14 启动暴露组在暴露后观察期内的总活动量低于 ZT2 启动暴露组。逐日分析同样表明，尽管两组在低氧开始后均出现活动骤降，但 ZT14 组下降幅度更大。由于 ZT14 对夜行性小鼠而言对应活动期早期，这一结果提示，内源性昼夜节律状态会调节机体对低氧应激的行为敏感性，即同样的高原低氧刺激在不同昼夜时相下引发的运动抑制程度并不相同。
在讨论部分，作者对研究发现进行了谨慎解释。首先，行为相位延迟而自由运行周期不变，提示低氧更可能影响相位调控、节律输出或下丘脑振荡器之间的耦联，而不是改变中央节律振荡器的内在步速。其次，跑轮活动属于下游行为输出，急性低氧可通过降低运动能力、改变觉醒状态、增加疲劳及直接抑制运动行为产生“掩蔽效应”，因此本研究尚无法区分 SCN 相位移动、下丘脑输出异常、振荡器耦联破坏与直接行为抑制之间的相对贡献。第三，转录组分析采用全下丘脑样本，无法将观察到的转录改变精确归因于 SCN 或其他特定核团，也不能排除不同细胞类型构成变化对整体表达谱的影响。第四，ZT2 与 ZT14 反应差异虽支持时相依赖性，但明暗状态、基础活动水平、摄食史、睡眠压力及先前能量消耗也均不同，可能共同影响行为结果。此外，体温、摄食饮水、体质量、能量消耗、底物利用、睡眠结构、应激激素分泌、通气和心血管功能等低氧相关全身变化在本研究中未被同步测量，因此仍可能对行为与转录表型产生中介或混杂作用。
研究结论部分可译为：高海拔暴露急性降低了小鼠的自主活动和节律振幅，并在不显著改变自由运行周期的情况下延迟行为昼夜节律相位。这些行为学变化伴随着全下丘脑节律性基因表达的广泛重组。松弛素相关信号通路是与时间性转录应答相关的若干候选通路之一。于 ZT2 与 ZT14 启动高海拔暴露所引起的运动反应亦存在差异，表明高海拔暴露的行为效应随昼夜节律相位而变化。综合而言，这些发现建立了高海拔低氧应激、昼夜节律相位与下丘脑节律性基因表达程序之间的关联。
