氧化应激与凋亡抑制减轻肝窦内皮细胞静态冷保存诱导的损伤

《Cells》：Oxidative Stress and Apoptosis Inhibition Mitigate Static Cold Storage-Induced Injury in Liver Sinusoidal Endothelial Cells

　　

供体肝脏的稀缺因保存相关损伤而加剧，尤其是缺血再灌注损伤（IRI），这降低了器官利用率并增加了丢弃率。肝窦内皮细胞（LSECs）在介导IRI中起关键作用，然而，它们对静态冷保存（SCS）的反应仍知之甚少。在此，研究人员研究了SCS对分离的大鼠LSECs的影响。将分离的大鼠肝细胞、星状细胞、库普弗细胞和LSECs进行长达3天的SCS，随后进行长达2天的恢复，同时LSECs还接受凋亡和/或氧化应激抑制处理。之后，测量了存活能力、功能和形态的变化。此外，还测量了基因、细胞因子和趋化因子表达的变化。研究人员发现，SCS使细胞活力降低约40%，伴随代谢活性和ATP水平下降60%，表明细胞能量代谢严重受损。SCS还使活性氧（ROS）产生加倍，并上调氧化应激和凋亡相关基因，导致LSECs功能下降。重要的是，联合抑制凋亡和氧化应激可将LSEC活力提高20%，代谢活性和ATP水平分别提高30%和40%，并将ROS产生降低50%。这些发现凸显了LSECs对保存损伤的脆弱性，以及理解LSEC特异性损伤机制的重要性，为开发靶向内皮的保存策略奠定基础，从而显著改善肝移植结局，进而增加获得这种挽救生命治疗的机会。

**论文解读**

**研究背景与问题**
肝移植是终末期肝病的唯一根治性治疗手段，但供肝短缺因保存相关损伤而加剧，尤其是缺血再灌注损伤（IRI），导致器官利用率降低和丢弃率增加。静态冷保存（SCS）作为临床标准，虽能延缓细胞代谢，却无法阻止保存损伤，且再灌注时加重细胞损伤，尤其影响肝脏微血管和胆道。肝窦内皮细胞（LSECs）作为高度特化的内皮细胞，在维持血管完整性、调节炎症和支持肝细胞功能中起核心作用，但它们在IRI中的具体损伤机制尚不明确。现有研究多集中于全器官水平，难以解析LSECs对保存损伤的细胞特异性反应。因此，有必要建立LSEC特异性体外保存模型，阐明其损伤机制并探索干预策略。

**研究内容与结论**
研究人员分离了大鼠LSECs、肝细胞、星状细胞（HSCs）和库普弗细胞（KCs），比较了SCS后不同细胞类型的损伤谱。发现LSECs在3天SCS后仍保持较高存活率，但功能显著下降，包括活性氧（ROS）产生增加、乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）摄取和肝素结合能力改变、通透性升高，以及超微结构损伤（如核膜分离、染色质聚集）。PCR阵列显示，3天SCS后恢复24小时导致促凋亡基因（如Bax、Casp3、Tp53）显著上调，氧化应激相关基因（如Sod2、Nqo1）表达紊乱。联合使用抗凋亡混合物CEPT（含Chroman 1、Emricasan、多胺和整合应激反应抑制剂）和抗氧化剂Trolox，可显著提高LSEC活力、代谢活性和ATP水平，降低caspase 3/7活性和ROS产生，部分恢复Ac-LDL摄取和肝素结合，但通透性和细胞因子分泌改善有限。该研究发表于《Cells》。

**关键技术方法**
研究人员从成年雌性Lewis大鼠分离肝细胞和肝非实质细胞（NPCs），通过密度梯度离心和差异贴壁法纯化LSECs、HSCs和KCs。细胞经1天或3天SCS（4°C，University of Wisconsin溶液）后，在标准培养条件下恢复24–48小时。采用Live/Dead染色、PrestoBlue代谢活性测定、ATP发光测定、caspase 3/7活性检测、H₂DCFDA荧光检测ROS、Ac-LDL摄取、肝素结合、FITC-葡聚糖通透性试验、透射电镜（TEM）观察超微结构，以及RT² Profiler PCR阵列检测细胞死亡和氧化应激相关基因表达。细胞因子/趋化因子通过27-plex免疫分析阵列检测。治疗组在SCS期间加入CEPT，恢复期间加入Trolox。

**研究结果**

**3.1 延长SCS及后续恢复对NPCs有害**
通过比较四种肝细胞，发现1天SCS后所有细胞活力>50%，但3天SCS后仅LSECs维持>50%活力，且LSECs的代谢活性和ATP水平显著高于肝细胞、HSCs和KCs，caspase 3/7活性较低，表明LSECs具有更大的拯救潜力。

**3.2 延长SCS及后续恢复对LSEC功能产生有害影响**
1天SCS使Ac-LDL摄取和肝素结合显著增加，但3天SCS后Ac-LDL摄取降至新鲜水平，肝素结合仍升高。SCS显著增加LSECs通透性。TEM显示SCS导致核膜分离、染色质聚集、吞噬体和脂滴含量增加，损伤随SCS时间延长而加重。SCS还引起多种细胞因子和趋化因子（如IL-1α、IL-4、MIP-1α、TNF-α、GRO、RANTES、EGF等）分泌增加。

**3.3 从延长SCS恢复导致LSEC细胞死亡和氧化应激基因表达增加**
PCR阵列显示，1天SCS（无论恢复与否）及3天SCS未恢复时仅引起轻微转录变化。而3天SCS后恢复24小时导致大量促凋亡基因（如Abl1、Apaf1、Bax、Casp3、Tp53）上调，以及坏死和自噬相关基因的少量变化，表明凋亡是主要死亡方式。氧化应激基因方面，恢复后ROS代谢基因（Sod2、Nqo1）上调，但大量抗氧化和氧转运基因下调，提示显著氧化应激。

**3.4 添加CEPT和Trolox使LSEC在延长保存时间后存活**
单独或联合使用CEPT和Trolox均能改善LSEC活力、代谢活性和ATP水平，降低caspase 3/7活性和ROS产生。联合治疗48小时效果显著，但PEG和热休克处理无效。

**3.5 CEPT和Trolox对LSEC功能和细胞因子/趋化因子表达有有益作用**
CEPT+Trolox治疗后，Ac-LDL摄取非显著增加，肝素结合显著降低，通透性无变化。TEM显示损伤指标大幅减轻。细胞因子检测中仅EGF分泌显著下降，其他细胞因子/趋化因子无明显变化，表明治疗主要改善存活而非完全恢复功能。

**总结与讨论**
该研究首次在细胞水平揭示LSECs对SCS的损伤响应不同于其他肝细胞，恢复期氧化应激是驱动凋亡的主要因素。联合抑制凋亡（CEPT）和氧化应激（Trolox）能部分改善LSEC存活，但功能恢复不完全，提示内皮功能障碍仍存在。这些发现强调了理解LSEC特异性损伤机制的重要性，为开发靶向内皮的保存策略（如机器灌注和低温保存）提供基础，有望改善肝移植结局并增加供肝利用。研究结论：本研究表明，LSECs的保存损伤时间线不同于肝细胞、HSCs和KCs。恢复期氧化应激是SCS后LSECs凋亡的重要驱动因素。虽然用CEPT抑制凋亡和Trolox抑制氧化应激可部分改善LSEC存活，但功能恢复仍不完全。这些结果突出了理解LSEC特异性损伤机制的重要性，并为开发新型靶向内皮细胞的保存策略以改善肝移植结局奠定基础，且对其它实体器官具有潜在适用性。