综述：同种异体CAR-T细胞制造中的质谱法：从细胞起始材料到多属性质量控制

《Cells》：Mass Spectrometry in Allogeneic CAR-T Cell Manufacturing: From Cellular Starting Materials to Multi-Attribute Quality Control

　　

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出显著的临床疗效，但其更广泛的应用受到制造复杂性和变异性（特别是在自体环境中）的限制。同种异体CAR T细胞疗法的发展提供了一种有前景的替代方案，通过实现可扩展的、'现成可用的'生产；然而，这些方法引入了与供体变异性、基因组编辑和产品一致性相关的额外挑战。因此，需要稳健的分析策略来确保安全性、有效性和批次间重复性。传统分析方法，如流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA），可对预定义的细胞和可溶性标志物进行靶向、高置信度测量，但在捕获CAR T细胞产品的全部分子和功能复杂性方面固有地受限。在当前制造范式中，这些检测通常作为孤立的质量控制读数部署，而不是作为整合控制策略的组成部分，该策略将供体变异性、基因编辑材料质量、过程中代谢状态、最终产品关键质量属性（CQAs）和临床生物标志物反应联系起来。在此背景下，质谱法（MS）已成为高维分子表征的强大平台，能够在CAR T细胞制造工作流程中分析基因编辑试剂、蛋白质、代谢物、脂质以及培养物和废培养基组成。在本综述中，研究人员研究了MS在同种异体CAR T细胞工作流程关键阶段的各种应用和工具，包括供体表征、基因编辑材料分析、过程中培养监测、药品质量评估和输注后生物标志物评估。总体而言，这些方法展示了MS驱动分析通过改进过程理解、实现全面质量评估和支持监管决策来解决CAR T细胞制造当前局限性的潜力。将MS整合到CAR T细胞工作流程中最终可能促进更一致、可扩展和有效的细胞疗法的发展。

**1. Introduction**
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已改变血液系统恶性肿瘤的治疗格局，但自体制造存在起始材料质量可变、供应链复杂和周期长等局限。同种异体CAR T细胞疗法利用健康供体细胞实现“现成可用”生产，但引入了供体变异性、基因组编辑和产品一致性的挑战。传统分析方法如流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）虽能测量预定义标志物，但难以捕获CAR T细胞产品的完整分子复杂性。质谱法（MS）作为一种高维分子表征平台，可分析蛋白质、代谢物、脂质和过程相关杂质，并支持关键质量属性（CQAs）的识别与过程理解。监管框架如质量源于设计（QbD）和过程分析技术（PAT）强调对CQAs的综合表征，而MS作为正交分析层，可补足传统检测的不足。本综述按工作流程阶段组织MS应用，包括供体表征、基因编辑材料评估、过程中培养监测、最终药品表征和输注后生物标志物评估，旨在阐明MS如何提升过程理解并促进一致、安全、有效的同种异体CAR T细胞疗法开发。

**2. From Donor to Drug Product: Multi-Stage Manufacturing of Allogeneic CAR-T Cells**
同种异体CAR T细胞制造是一个多阶段、严格控制的过程，从健康供体起始材料生成均匀的冷冻保存产品。过程包括供体筛选、白细胞分离、T细胞富集与激活、基因工程（如CRISPR/Cas9介导的T细胞受体⁺细胞敲除）、体外扩增、收获与制剂、冷冻保存和最终产品放行测试。每个阶段均引入变异性，需要稳健的分析表征。MS在过程中作为阶段特异性正交分析层：供体阶段捕获基线分子变异性；基因编辑材料确保试剂质量；过程中监测代谢或表型漂移；药品支持CQA发现、可比性和杂质研究。不同MS应用的成熟度各异，靶向基因编辑材料、废培养基和杂质检测更接近实施，而全局组学和单细胞MS仍处于发现和机制构建阶段。MS的翻译成熟度取决于制造输入：非细胞起始材料（如单链向导RNA（sgRNA）、mRNA）的MS工作流已实现GMP放行，而细胞中间体和最终产品主要服务于发现、过程开发和可比性研究。

**3. Donor and Leukapheresis: Cellular Starting Material Characterization**
供体与白细胞分离材料表征是MS应用的天然切入点，因健康供体起始材料可在大规模生产前选择、比较和表征。MS可补充供体资格检测、流式细胞术和功能检测，提供细胞和系统层面的分子信息。采样策略包括细胞层面（外周血单个核细胞（PBMC）或富集T细胞）和系统层面（血浆或血清）。全局细胞蛋白质组学通过数据依赖性采集（DDA）、数据非依赖性采集（DIA）或串联质量标签（TMT）识别供体相关蛋白程序，如T细胞受体（TCR）信号、代谢准备和凋亡调控。血浆/血清蛋白质组学捕获炎症、补体、凝血等系统协变量，但需注意高丰度蛋白掩蔽效应。代谢组学和脂质组学提供氨基酸、核苷酸、脂质等通路信息，与T细胞激活和分化紧密相关，但易受饮食、抗凝剂等前分析变量影响。单细胞表型分析如质谱流式细胞术（CyTOF）可高维免疫表型，揭示稀有或失衡细胞状态。靶向蛋白质组学（如多反应监测（MRM）、平行反应监测（PRM））将发现标志物转化为定量检测，但需锚定制造终点（如扩增动力学、效力）。MS整体上作为发现到翻译的管道，候选标志物需经严格验证才能纳入供体材料属性面板。

**4. Mass Spectrometry for the Characterization of Gene Editing Starting Materials**
同种异体CAR T细胞制造依赖精确的多重基因组编辑，起始材料包括单链向导RNA（sgRNA）、信使RNA（mRNA）、核酸酶、核糖核蛋白（RNP）复合物和DNA转导模板。对于sgRNA，离子对反相液相色谱-电喷雾电离质谱（IP-RPLC-ESI-MS）用于完整质量确认和序列相关杂质检测，循环离子淌度质谱（cIMS）可提高序列覆盖率并解析硫代磷酸酯（PS）立体异构体。天然质谱（nMS）结合尺寸排阻色谱（SEC）可检测非共价聚集体和结构变异，其敲除效率降低10%且脱靶编辑增加。对于mRNA，酶切图谱（如核糖核酸酶T1（RNase T1））结合LC-MS实现高序列覆盖，靶向切割策略分析5′帽结构和3′多聚腺苷酸（poly(A)）尾长度分布，天然质谱可检测双链RNA（dsRNA）副产物。对于核酸酶（如Cas9），完整蛋白质量分析确认分子量并检测翻译后修饰（PTMs），肽图分析定位氧化、脱酰胺等，氢-氘交换质谱（HDX-MS）探究构象动力学。对于RNP复合物，nMS解析组装状态，离子淌度质谱（IM-MS）提供碰撞截面（CCS）区分构象亚群，交联质谱（XL-MS）映射蛋白-RNA互作界面。对于双链DNA（dsDNA）质粒，电荷检测质谱（CD-MS）通过单粒子电荷分布区分超螺旋、开环和线性拓扑结构，确保模板批次均匀性。这些MS方法为基因编辑起始材料的多属性质量控制提供了标准分析蓝图。

**5. MS-Based In-Process Monitoring and PAT During CAR T-Cell Expansion**
在体外扩增阶段，MS可作为过程分析技术（PAT）支持过程控制。靶向代谢物监测（如REBEL/REBEL XT平台）通过微型毛细管电泳-质谱（CE-MS）分析废培养基中的氨基酸、二肽和胆碱，支持补料调整和收获时机决策。非靶向代谢组学和通量组学（如稳定同位素示踪）用于过程开发，揭示代谢重塑与细胞状态的关系。分泌组蛋白质组学通过多反应监测（MRM）定量细胞因子和趋化因子，但灵敏度受限。细胞表面蛋白质组学（如糖捕获糖蛋白组学）可识别激活、缺氧等条件下的表面重塑，支持过程表征。脂质组学分析膜脂、鞘脂和甘油磷脂，揭示与分化、功能相关的膜结构变化。自动化和数据集成方面，REBEL和MAVEN（在线葡萄糖/乳酸分析仪）展示了靶向MS与传感器的结合。MS基PAT的价值在于将分子读数连接到可操作的制造参数（如扩增率、活力、表型），但需建立内部标准、校准曲线和批次效应管理。整体上，靶向MS提供更丰富的培养基成分谱，而组学方法更适合过程开发和CQA发现。

**6. Final Drug Product Characterization**
最终药品表征整合了供体、基因编辑、扩增、冻存等阶段的变异性。常规放样检测（如流式细胞术、ELISA）无法完全解析活细胞产品的分子状态，MS作为正交平台用于CQA发现、可比性和缺陷批调查。全局蛋白质组学/磷酸蛋白质组学可量化激活、细胞毒性、耗竭、凋亡和应激反应相关蛋白，磷酸蛋白质组学更直接反映信号通路活性。单细胞质谱流式细胞术（CyTOF）通过重金属标记抗体解析产品异质性，识别分化、耗竭等亚群比例变化。代谢组学和脂质组学评估免疫代谢适应度，如长期应答者产品显示氧化磷酸化升高等特征。冷冻保存应激可通过蛋白质组学、代谢组学和脂质组学深入表征，指导制剂开发。过程相关杂质（如激活试剂、细胞因子、基因编辑试剂残留）的MS分析提供分子特异性，补充ELISA。翻译到靶向CQA需将发现特征与功能终点关联，开发多属性方法（MAM）或PRM面板用于可比性和稳定性监测。当前MS仍面临破坏性采样、高细胞输入和周转时间等限制，主要用于过程开发和可比性研究，而非常规放样。

**7. Post-Infusion Biomarker and Translational Monitoring**
输注后监测当前依赖临床评估、细胞因子检测和流式细胞术，MS作为新兴转化层连接产品属性与患者分子反应。血浆/血清蛋白质组学可分析炎症、补体、凝血、内皮损伤和组织损伤蛋白，代谢组学/脂质组学捕获代谢应激、线粒体功能障碍和氧化还原失衡。但前分析变量（如抗凝剂、溶血、冻融史）易产生伪象，需严格控制的临床采样和验证。MS最有价值的作用是在注释良好的转化研究中，通过发现阶段提名候选毒性或应答特征，再转化为靶向检测（如PRM、反应监测（SRM））。目前，已验证的输注后MS生物标志物仍处于临床开发阶段，需定义生物标志物应用环境、分析验证和监管合规。

**8. Conclusions**
在同种异体CAR T细胞工作流程中，MS扮演两种不同角色：对于上游基因编辑组分，MS已作为正式GMP放行方法（如sgRNA完整质量分析、5′帽和poly(A)尾分布）；对于细胞过程中监测和最终药品，MS主要作为过程开发、CQA识别、可比性和杂质控制的正交平台。操作限制（如破坏性采样、高细胞输入、周转时间）限制了细胞产品MS放样检测的常规应用，但靶向MS面板（如MAM、PRM）为可比性和生命周期管理提供了现实桥梁。未来，MS的整合需克服资本投资、数据周转和专业知识壁垒，其价值在于通过系统级分子表征加强过程理解，促进更一致、可扩展的细胞疗法开发。本综述中描述的MS模态和工具（如寡核苷酸图谱、废培养基分析、宿主细胞蛋白杂质表征和免疫代谢适应度监测）可扩展至自体CAR-T、T细胞受体工程T细胞（TCR-T）、CAR-自然杀伤细胞（CAR-NK）和干细胞衍生疗法，为整个细胞疗法领域提供通用分析框架。