绿色合成的Curcuma longa衍生的银纳米颗粒用于口腔生物材料应用：理化表征、抗菌活性、初步细胞相容性和在卵生物相容性筛选

《Journal of Functional Biomaterials》：Green-Synthesized Curcuma longa-Derived Silver Nanoparticles for Oral Biomaterial Applications: Physicochemical Characterization, Antibacterial Activity, Preliminary Cytocompatibility and In Ovo Biocompatibility Screening

　　

背景/目的：植物介导的银纳米颗粒（AgNPs）因其抗菌潜力而成为口腔生物材料中的有前景组分；然而，其生物学行为强烈依赖于植物化学基质、理化特性和暴露浓度。该研究旨在评估使用姜黄粉衍生的姜黄（Curcuma longa）乙醇和水提物合成的银纳米颗粒制剂，重点关注理化表征、对口腔相关革兰氏阳性菌的抗菌活性、对人牙龈成纤维细胞（HGF-1）的细胞相容性以及急性在卵血管相容性。方法：使用CUR-EtOH和CUR-H₂O提取物作为还原和稳定基质，合成了AgCUR-EtOH NPs和AgCUR-H₂O NPs。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、动态光散射（DLS）、zeta电位分析、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）和能量色散X射线光谱（EDX）对所得制剂进行表征。确定了针对变形链球菌（Streptococcus mutans）、口腔链球菌（Streptococcus oralis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。使用互补的活力、溶酶体、线粒体和荧光基测定法，评估HGF-1人牙龈成纤维细胞在暴露于1-10 μg/mL浓度24 h后的细胞相容性。使用鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET-CAM）评估急性血管刺激性。结果：两种制剂均呈现宽泛的多分散流体动力学分布和负的表观zeta电位。在其各自的溶剂特异性测量条件下，AgCUR-H₂O NPs的Z-均直径低于AgCUR-EtOH NPs。XRD图谱显示异质晶体组成，以残留的AgNO₃为主，同时存在与金属Ag一致的较弱贡献以及可能的微量氧化银相。FTIR光谱显示了提取物衍生的有机官能团和显著硝酸盐相关谱带。TEM/EDX证实了含银纳米结构的存在，AgCUR-EtOH NPs的近似尺寸范围为15–175 nm，AgCUR-H₂O NPs为15–150 nm。变形链球菌是最敏感的微生物，AgCUR-EtOH NPs和AgCUR-H₂O NPs的MIC值分别为9和7 μg/mL，MBC值分别为88和62 μg/mL。AgCUR-H₂O NPs对所有测试菌株均持续显示较低的MIC和MBC值，但也导致更显著的浓度依赖性HGF-1活力降低。在10 μg/mL浓度下，AgCUR-EtOH NPs的细胞活力为71.88%，AgCUR-H₂O NPs为52.14%。两种制剂在卵中均显示出低急性刺激性潜力，刺激性评分分别为1.06和0.69。结论：两种CUR-AgNP制剂在测试条件下表现出不同的理化、抗菌和细胞响应谱。在同等浓度的总干制剂质量下，AgCUR-H₂O NPs针对测试菌株的MIC和MBC值较低，而AgCUR-EtOH NPs对HGF-1活力的降低程度较小。由于粉末未对总银、提取物衍生的有机组分或残留前体含量进行定量归一化，因此这些差异不能完全归因于纳米颗粒特性或提取溶剂，也不应解释为任一制剂固有优越性的证据。两种制剂均显示低急性血管刺激性。在纳入口腔生物材料平台之前，需要进行进一步的定量组成、银释放和生物膜评估。

本文解读基于《Journal of Functional Biomaterials》发表的论文《Green-Synthesized Curcuma longa-Derived Silver Nanoparticles for Oral Biomaterial Applications: Physicochemical Characterization, Antibacterial Activity, Preliminary Cytocompatibility and In Ovo Biocompatibility Screening》。研究背景方面，纳米技术在口腔生物材料领域具有重要应用前景，银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌活性而备受关注，但其生物学效应受粒径、表面化学、稳定剂和浓度等因素强烈影响。传统物理化学合成方法常使用强还原剂或有机溶剂，限制了其生物医学适用性。绿色合成利用植物提取物中的植物化学物质作为还原和稳定剂，是一种更可持续的替代方案。姜黄（Curcuma longa）富含姜黄素类、多酚和黄酮类等活性成分，可用于AgNPs的绿色合成，但提取溶剂（乙醇和水）不同会导致植物化学组成差异，进而影响纳米颗粒的理化特性和生物学行为。目前，关于溶剂依赖性姜黄提取物合成的AgNPs在口腔生物材料领域的系统对比研究仍有限。因此，本研究旨在利用姜黄粉衍生的乙醇和水提取物作为还原和稳定基质，合成AgCUR-EtOH NPs和AgCUR-H₂O NPs，并对其理化特性、对口腔相关革兰氏阳性菌的抗菌活性、对人牙龈成纤维细胞（HGF-1）的细胞相容性以及急性在卵血管刺激性进行综合评估，为后续开发口腔生物材料平台提供基础。

为开展研究，研究人员采用了以下关键技术方法：（1）利用姜黄粉衍生的乙醇（CUR-EtOH）和水（CUR-H₂O）提取物，在60°C下与AgNO₃反应合成AgCUR-EtOH NPs和AgCUR-H₂O NPs，随后离心、干燥并研磨成粉末；（2）使用紫外-可见光谱（UV-Vis）、动态光散射（DLS）、zeta电位分析、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）和能量色散X射线光谱（EDX）进行理化表征；（3）通过肉汤微量稀释法测定针对变形链球菌（ATCC 25175）、口腔链球菌（ATCC 9811）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；（4）使用HGF-1人牙龈成纤维细胞系（CRL-2014），通过MTT法、中性红摄取（NRU）法、JC-1线粒体膜电位染色、MitoTracker? Red CMXRos/Hoechst 33342荧光染色以及吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双染法，在1–10 μg/mL浓度范围内评估细胞相容性；（5）采用鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET-CAM）评估急性血管刺激性，以蒸馏水为阴性对照，1%十二烷基硫酸钠（SDS）为阳性对照。

研究结果部分，研究人员通过以下小标题逐步展示了发现：

3.1 理化表征：UV-Vis光谱显示两种制剂的反应进程具有基质依赖性光学特征，AgCUR-H₂O NPs在400 nm附近吸收逐渐增强，而AgCUR-EtOH NPs呈现宽泛吸收，未出现清晰局域表面等离子体共振峰。DLS和zeta电位分析表明，在各自溶剂中，AgCUR-H₂O NPs的Z-均流体动力学直径（264 nm）低于AgCUR-EtOH NPs（1742 nm），两者均呈现负的表观zeta电位（分别为-21.8 mV和-20.4 mV）。XRD图谱显示两种制剂均以残留的结晶AgNO₃相为主，并存在与面心立方金属Ag（fcc Ag）一致的较弱衍射峰，以及可能的微量Ag₆O₂相；Scherrer分析显示AgNO₃晶粒尺寸分别为82.0 nm和68.2 nm。FTIR光谱证实了提取物衍生的有机官能团（如O-H、C-H、C=C、C-O）和显著的硝酸盐谱带（约1380 cm^-1和824 cm^-1），AgCUR-H₂O NPs在523 cm^-1处出现微弱Ag-O振动。TEM/EDX确认了含银纳米结构的存在，AgCUR-EtOH NPs尺寸范围15–175 nm，AgCUR-H₂O NPs为15–150 nm，两者均呈多分散形貌。

3.2 抗菌活性：MIC和MBC测定显示，变形链球菌最为敏感，AgCUR-H₂O NPs的MIC和MBC分别为7和62 μg/mL，AgCUR-EtOH NPs分别为9和88 μg/mL。金黄色葡萄球菌和口腔链球菌的敏感性较低，AgCUR-H₂O NPs对两者的MIC分别为138和157 μg/mL，MBC分别为192和385 μg/mL；AgCUR-EtOH NPs的MIC分别为168和235 μg/mL，MBC分别为266和462 μg/mL。AgCUR-H₂O NPs对所有测试菌株均表现出更低的MIC和MBC值。

3.3 体外细胞相容性：MTT法显示，HGF-1细胞活力随浓度增加而降低，AgCUR-EtOH NPs在10 μg/mL时活力为71.88%，而AgCUR-H₂O NPs仅为52.14%。明场显微镜观察显示，AgCUR-EtOH NPs仅引起轻微细胞融合度降低，而AgCUR-H₂O NPs在5和10 μg/mL时导致明显的细胞形态改变（圆缩、收缩）。NRU法表明，AgCUR-EtOH NPs在10 μg/mL时溶酶体功能保留较好（79.87%），而AgCUR-H₂O NPs在10 μg/mL时降至61.99%。JC-1线粒体膜电位检测显示，AgCUR-EtOH NPs在10 μg/mL时膜电位为对照组的74.41%，而AgCUR-H₂O NPs降至48.33%。MitoTracker/Hoechst染色显示，AgCUR-EtOH NPs的凋亡指数从1 μg/mL的3.93%增至10 μg/mL的10.10%，而AgCUR-H₂O NPs从5.22%增至13.60%。AO/PI染色表明，两种制剂均以绿色荧光为主，PI阳性细胞稀少，提示细胞膜完整性未严重受损，但AgCUR-H₂O NPs诱导更明显的凋亡样核改变。

3.4 在卵生物相容性：HET-CAM试验中，AgCUR-H₂O NPs的刺激性评分（IS）为0.69，分类为非刺激性；AgCUR-EtOH NPs的IS为1.06，分类为轻微刺激性（接近非刺激性阈值）。阴性对照（蒸馏水）IS为0.07，阳性对照（1% SDS）为19.73。两种制剂均未引起明显出血、血管溶解或凝血。

讨论部分，研究人员指出，两种CUR-AgNP制剂在理化特性、抗菌活性和细胞响应上存在差异，这些差异与提取溶剂导致的植物化学基质不同有关。AgCUR-H₂O NPs具有更小的流体动力学尺寸和更强的抗菌活性，但同时对HGF-1细胞表现出更明显的细胞毒性。AgCUR-EtOH NPs则表现出更好的细胞相容性，但抗菌活性较弱。两种制剂均显示低急性血管刺激性。然而，由于粉末未对总银、有机组分和残留前体进行定量归一化，这些差异不能直接归因于纳米颗粒特性或提取溶剂，而是反映了制剂依赖性的综合效应。研究结论部分翻译如下：本研究证明了利用姜黄粉衍生的乙醇和水提取物作为不同植物化学基质进行含银纳米制剂绿色合成的可行性。互补的理化分析揭示了制剂依赖性特征。UV-Vis光谱显示了基质依赖的光学轮廓并支持合成反应进展，DLS表明重新分散后存在宽泛多分散的流体动力学分布。在各自溶剂特异性测量条件下，AgCUR-H₂O NPs的Z-均流体动力学直径低于AgCUR-EtOH NPs，两种制剂均显示负的表观zeta电位。XRD表明异质晶体组成以残留结晶AgNO₃为主，同时存在与金属Ag一致的较弱反射以及可能的微量氧化银贡献。FTIR分析鉴定出提取物衍生的含氧官能团和显著的硝酸盐谱带，支持植物化学和前体衍生组分在最终干燥制剂中的共存。TEM和EDX进一步证实了含银纳米结构的存在，AgCUR-EtOH NPs的近似尺寸范围为15–175 nm，AgCUR-H₂O NPs为15–150 nm。综合来看，这些发现表明所得粉末代表复杂的含银纳米制剂，而非组成均匀的纯化金属AgNPs。两种制剂均对三种测试革兰氏阳性菌株表现出抗菌活性，变形链球菌最为敏感。在同等总干制剂质量浓度下，AgCUR-H₂O NPs对变形链球菌、金黄色葡萄球菌和口腔链球菌的MIC和MBC值持续低于AgCUR-EtOH NPs。HGF-1实验显示不同制剂依赖性的细胞响应。在同等总制剂浓度下，AgCUR-EtOH NPs对细胞活力、溶酶体功能、线粒体膜电位以及细胞和核完整性的降低程度小于AgCUR-H₂O NPs。然而，这些差异不能完全归因于纳米颗粒尺寸、提取溶剂或固有银纳米颗粒特性，因为两种粉末的实际银、有机和残留前体含量未进行定量归一化。两种制剂在HET-CAM模型中于10 μg/mL浓度下均显示低急性血管刺激性。AgCUR-H₂O NPs分类为非刺激性，而AgCUR-EtOH NPs仅产生非常低/轻微刺激性反应，接近非刺激性阈值。总体而言，本研究为含CUR-AgNP口腔生物材料的进一步开发提供了理化、抗菌和初步生物学基础。AgCUR-EtOH NPs和AgCUR-H₂O NPs应视为组成上不同的制剂，在实验条件下产生了不同的抗菌和细胞响应，而非生物学等效剂量的纯化AgNPs。未来工作将聚焦于定量组成表征、银物种释放评估、口腔生物膜模型评价以及将纳米制剂纳入实验性牙科或正畸粘接系统。