《International Journal of Molecular Sciences》：Integrative Bioinformatics and Machine Learning Analysis Identifies Novel Molecular Biomarkers in Prostate Adenocarcinoma
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从子宫颈获取滋养层细胞（trophoblast retrieval from the cervix, TRIC）是一种非侵入性方法，能够在妊娠早期（最早从孕早期开始）获取胎儿来源的绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast, EVT），为
从子宫颈获取滋养层细胞（trophoblast retrieval from the cervix, TRIC）是一种非侵入性方法，能够在妊娠早期（最早从孕早期开始）获取胎儿来源的绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast, EVT），为早期胎盘和胎儿评估提供了独特机会。尽管TRIC已被报道在孕5至20周之间可行，但使用互补分析方法对早孕期EVT回收进行系统性评估仍有限。本研究旨在提供早孕期EVT回收的多方法评估。研究人员从53名孕5至19周的孕妇中收集了宫颈内样本。通过使用人白细胞抗原-G（human leukocyte antigen-G, HLA-G）特异性抗体的免疫磁分离法分离EVT细胞，并通过β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）免疫荧光、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）进行评估。免疫荧光和FISH分析显示，各孕周组的β-hCG阳性细胞比例或胎儿细胞比例无显著差异，支持基于TRIC的回收在早孕期具有稳定性。探索性FACS分析识别出HLA-G阳性滋养细胞群体，包括在孕5周获得的样本中。由于FACS分析仅在一部分队列中进行，这些发现应视为探索性，并需在更大规模的队列研究中验证。总体而言，研究结果支持TRIC在整个早孕期的可行性，并确认了最早从孕5周即可成功回收胎儿来源的EVT细胞。需要进一步使用更大队列和标准化定量方法的研究，以更全面地描述早孕期EVT回收特征，并优化TRIC在胎盘和产前研究中的应用。
**论文解读：基于多方法评估的早孕期宫颈滋养细胞回收研究**
**研究背景与问题**
胎盘是母胎沟通的关键器官，其正常发育对胎儿生长和妊娠维持至关重要。绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast, EVT）在早期胎盘形成过程中侵入母体蜕膜、子宫血管和子宫内膜腺体，建立母胎界面并确保胎盘灌注。EVT分化与侵入异常与多种妊娠并发症相关，如子痫前期、胎儿生长受限、复发性流产和植入失败。因此，EVT细胞不仅是产前遗传分析的目标，也是研究胎盘生物学和妊娠相关疾病的重要工具。
子宫颈滋养细胞获取（trophoblast retrieval from the cervix, TRIC）作为一种非侵入性方法，可在早孕期直接获取含有完整胎儿基因组的EVT细胞，为早期产前诊断提供更直接、更准确的途径。与依赖母体血浆中游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA, cffDNA）的常规无创产前检测（non-invasive prenatal testing, NIPT）相比，TRIC避免了低胎儿分数、胎盘来源cffDNA及局限性胎盘嵌合体等限制。然而，尽管TRIC已在孕5至20周被证明可行，但大多数既往研究主要集中于技术可行性和优化，对早孕期EVT回收量的定量动态变化研究有限。由于滋养细胞回收效率直接影响下游分子应用，系统了解早孕期EVT回收特征对于优化TRIC的临床应用至关重要。
**研究目的与意义**
本研究旨在使用互补分析方法，评估TRIC在早孕期不同孕周的EVT回收情况，特别关注最早孕5周是否能够持续回收胎儿滋养细胞。研究结果支持TRIC在早孕期的可行性和相对稳定性，为早期产前诊断和胎盘研究提供了方法学基础。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**主要技术方法**
本研究涉及以下关键方法：1）宫颈内取样：使用细胞刷（cytobrush）在孕5-19周孕妇中采集宫颈内样本（样本来源：韩国江南车医院，53名孕妇）。2）免疫磁分离：使用偶联抗人白细胞抗原-G（human leukocyte antigen-G, HLA-G）抗体的磁性纳米颗粒富集EVT细胞。3）免疫荧光：对分离的HLA-G阳性细胞进行β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）免疫荧光染色，定量评估滋养细胞阳性率。4）荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）：使用Y染色体探针或21号染色体探针鉴定胎儿细胞，计算胎儿细胞比例。5）荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）：对部分样本进行HLA-G阳性细胞群体的流式细胞术分析，通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设门，并以CD45阴性排除母体白细胞。
**研究结果**
**2.1 孕周依赖性EVT细胞回收**
**2.1.1 各孕周组的基线特征**：将53个样本分为三组（5-7周、8-12周、13-19周），各组孕周有显著差异（p<0.05），而母体年龄、身体质量指数（BMI）、孕次和产次无差异（均p>0.05）。β-hCG阳性率与孕周、母体年龄、BMI、孕次、产次均无显著关联（均p>0.05）。
**2.1.2 基于免疫荧光的EVT细胞定量**：对所有孕周组进行β-hCG免疫荧光染色，β-hCG阳性率在63.2%~72.8%之间，组间无统计学差异，表明滋养细胞比例在早孕期相对稳定。值得注意的是，HLA-G阳性细胞计数在8-12周组显著高于5-7周组（p<0.05），而13-19周组又显著低于8-12周组（p<0.05），但5-7周与13-19周组间无显著差异，计数相似。
**2.1.3 基于FISH的胎儿细胞比例评估**：利用Y染色体探针（男性胎儿）或21号染色体探针（唐氏综合征）鉴定胎儿细胞。FISH检测的胎儿细胞比例在13-19周组略有上升（20.2%），但组间差异无统计学意义。
**2.2 基于FACS的HLA-G阳性滋养细胞群体评估**：对代表性样本进行FACS分析，在孕5周5天时，HLA-G染色组的FITC阳性细胞占25.25%（对照组12.61%）；在孕8周时，阳性细胞增至50.76%（对照组13.02%）。结果表明HLA-G阳性滋养细胞最早可在孕5周检测到，但由于样本量有限，这些发现为探索性，需谨慎解释。
**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究通过多方法评估了早孕期TRIC的EVT回收情况，发现免疫荧光和FISH分析显示β-hCG阳性率和胎儿细胞比例在各孕周组间无显著差异，支持稳定的滋养细胞回收。探索性FACS分析在孕5周样本中检测到HLA-G阳性细胞，进一步证实早孕期可行性。但FACS趋势未完全反映在免疫荧光或FISH中，可能由于显微镜技术观察细胞数量有限且受观察者影响，而FACS可定量分析数千个细胞，对细微差异更敏感。研究强调分析方法对EVT表征的重要性。
与既往研究相比，本研究的β-hCG阳性率（63-73%）低于部分报道（>90%），但可能因分析策略不同（本研究以总回收细胞为分母，而非仅高纯度富集群体）。此外，既往研究对孕周对滋养细胞回收影响的结果不一致，本研究通过多方法评估提供了更全面的视角。
TRIC可获取完整胎儿基因组，回收细胞的数量和质量直接影响下游分子分析（如染色体分析、胎儿基因分型、二代测序等）的成功率。本研究还发现TRIC最早在孕5周即可回收胎儿来源EVT细胞，早于常规NIPT（约9-10周），为早期产前诊断提供了独特窗口。
**研究局限性**：亚组样本量较小，可能限制统计效力；细胞计数为绝对回收数而非标准化数值，受采样效率变异影响；FISH分析仅限于明确可识别胎儿细胞（男性胎儿或染色体非整倍体）的病例，可能不具代表性；FACS分析仅针对部分样本，为探索性；未评估下游诊断性能；且无法完全排除胎盘异质性和局限性胎盘嵌合体的影响。
**研究结论**：尽管TRIC在产前诊断和胎盘研究中具有巨大潜力，但相对较少的研究使用互补分析方法系统评估早孕期胎儿滋养细胞回收。本研究通过免疫荧光和FISH分析支持TRIC在早孕期胎儿滋养细胞回收的可行性和相对稳定性。此外，最早从孕5周即可成功回收胎儿来源的EVT细胞，进一步支持TRIC在早孕期的可行性。需要进一步使用更大队列和标准化定量方法的研究，以更精确地描述早孕期EVT回收特征，并进一步优化基于TRIC的分子和诊断应用。
