MRP3的等位基因特异性甲基化驱动海洋硅藻交配型决定

《SCIENCE ADVANCES》：Allele-specific methylation of MRP3 drives mating type determination in a marine diatom

　　

摘要
性别决定机制在真核生物谱系中表现出显著的多样性。在羽纹硅藻Pseudo-nitzschia multistriata中，性别由MRP3（一个功能未知的基因）决定，该基因在具有性能力的交配型阳性（MT⁺）细胞中呈单等位基因表达，而在MT^?细胞中沉默。研究人员在此描述了性别位点上的等位基因特异性甲基化模式：一个与MT⁺特异性的低甲基化等位基因具有转录活性，而其他高甲基化的MRP3等位基因则转录沉默。此外，全基因组甲基化景观在整个生命周期中保持稳定。用甲基化抑制剂处理导致MRP3激活和部分性逆转，表明DNA甲基化在性别决定机制中发挥积极作用。长读长测序提高了MT决定区域的分辨率，突显出一个基因贫乏、重复序列丰富的区域，该区域可能代表一个原始的MT决定位点。研究结果提供了对性别决定机制的见解，并表明硅藻中DNA甲基化的作用比沉默重复区域更为复杂。

本文解读如下：

**研究背景、存在问题及研究意义**
性别决定机制在真核生物中高度多样，但在原生生物中仍未被充分探索。在单细胞生物中，决定细胞身份和指导有性发育的基因编码在基因组中被称为交配型（MT）位点的特殊区域，类似于性染色体。硅藻是单细胞光合微藻，贡献了地球上约20%的氧气，相当于全球雨林的产氧量。尽管其生态重要性显著，但关于硅藻生命周期转换的分子控制以及性别决定机制的研究非常有限。硅藻细胞被包裹在硅质细胞壁（frustule）中，由两个壳瓣组成，这种刚性结构在细胞分裂时造成约束：每次有丝分裂中，子细胞继承不同大小的壳瓣，导致种群细胞尺寸逐渐减小，最终可能灭绝。有性生殖通过重组引入遗传多样性并恢复细胞大小，从而确保物种存续。进入性周期的能力与细胞尺寸减小相关，只有达到性化尺寸阈值（SST）的细胞才具有性能力。然而，硅藻细胞如何感知自身尺寸并决定是否交配仍然是一个未解之谜。研究人员假设表观遗传调控可能参与这一过程。在P. multistriata中，此前已鉴定出MT位点和MT决定基因MRP3，该基因在MT⁺菌株中单等位基因表达，在MT^?中沉默。不同MRP3等位基因存在多态性，但未能找到普遍适用于所有地理种群的MT特异性基因组结构。本研究旨在探究DNA甲基化在性能力获得和性别决定机制中的作用。

**主要关键技术与方法**
研究人员使用了酶促甲基测序（EM-seq）技术，以单碱基分辨率分析P. multistriata的胞嘧啶甲基化图谱，样本包括来自意大利那不勒斯湾、新西兰的野生菌株以及实验室杂交菌株，涵盖大细胞（L，>55 μm）和小细胞（S，<55 μm）以及不同MT。此外，还利用Oxford Nanopore技术对MT⁺菌株AB6进行长读长测序，以改进MT决定区域的分辨率。通过5-氮杂胞苷（5-aza-dC）处理抑制DNA甲基化，并用定量PCR（qPCR）检测MRP3及相关基因的表达变化，通过交配实验评估性逆转表型。

**研究结果**

**生命周期转换中的甲基化景观**
研究人员对14个样品进行了EM-seq分析，发现P. multistriata中绝大多数甲基化胞嘧啶位于CpG二核苷酸中，约5-10%的CpG被甲基化，CHG和CHH背景的甲基化水平低于1%。主成分分析（PCA）显示，样品根据地理来源和谱系分离。高甲基化基因（HMG）中，MRP3是唯一在不同MT间表现出差异甲基化和差异表达的基因：在MT⁺中甲基化水平约为MT^?的一半，且仅在小型MT⁺细胞中表达。比较不同大小细胞时未发现CpG背景的差异甲基化区域（DMR），表明甲基化模式在尺寸减小过程中保持稳定；而比较MT⁺与MT^?时，鉴定出218个DMR，其中仅MRP3基因同时表现出差异甲基化和差异表达。

**MRP3差异甲基化是等位基因特异性的且可遗传**
在MT^?菌株中，两个MRP3等位基因均高度甲基化（约77% CpG甲基化），而MT⁺中仅一个等位基因甲基化（约42%），转录活性等位基因是低甲基化的。该模式在大细胞和小细胞中保持一致。在新西兰菌株NZ5中，MRP3的两个等位基因结构相同但甲基化程度不同，且转录活性等位基因同样为低甲基化，证实了等位基因特异性甲基化与表达的关系。

**假定的MT位点在不同等位基因中显示重排**
通过长读长测序组装了MT⁺菌株AB6的基因组，发现MRP3所在的区域基因贫乏、重复序列丰富。A等位基因的MT位点长约25 kb，B等位基因因易位和重复序列插入而长约37 kb。B等位基因中MRP3编码区被一个简单重复序列中断，导致移码。该区域中唯一的其他基因0020760在A等位基因中缺失，在B等位基因中靠近位点边界，其表达可能受位置影响。

**抑制甲基化解除MRP3表达并诱导部分性逆转**
用5-aza-dC处理三个MT^?菌株（1339-5、1339-1、VD10）后，1339-5菌株表现出部分性逆转，能与同型MT和异型MT交配，而其他两个菌株仅与异型MT交配。甲基化分析显示，1339-5和1339-1的全基因组甲基化水平分别下降约32%和26%，MRP3位点甲基化显著降低；VD10甲基化下降较少（约18%），MRP3甲基化无明显变化。qPCR检测表明，在发生性逆转的1339-5菌株中，MRP1、MRP2和MRP3显著上调，而MT^?标记基因表达不变。在未发生性逆转的菌株中，仅MRP1上调。洗脱实验显示，去除药物后MRP3表达部分恢复沉默，表明甲基化模式可通过有丝分裂重建。

**讨论与结论**
研究表明，MRP3的等位基因特异性甲基化是P. multistriata性别决定的关键机制：在MT^?中，两个等位基因均高甲基化而沉默；在MT⁺中，一个低甲基化等位基因确保表达，驱动性别决定。这种表观遗传调控类似于基因组印记，但在此表现为等位基因效应而非亲本效应。由于甲基化模式在大细胞和小细胞中维持，DNA甲基化并非性能力转换的主要调控机制，而是维持了MT⁺特异性等位基因的表达状态。研究人员推测，一个假定的转录因子在SST转换时在两种MT中均被激活，但只能结合MT⁺中未甲基化的等位基因。结构变异分析表明，MT⁺特异性等位基因可通过序列特征区分，但新西兰菌株中两个结构相同的等位基因具有不同的甲基化状态，提示可能存在其他机制。甲基化抑制实验诱导的部分性逆转支持了甲基化在性别决定中的主动作用。此外，P. multistriata的MT位点是一个基因贫乏、重复序列丰富的原始性别决定区域，类似于非重组性染色体区域，重复序列的积累与重组抑制相关。长读长测序揭示了不同等位基因间的易位、倒位等结构变异，并发现B等位基因中MRP3编码区被重复序列插入破坏，证实了非转录等位基因中功能丧失突变的积累。该机制在来自新西兰的遗传距离最远的菌株中也得到验证，表明其普遍性。

**研究结论**
研究人员在P. multistriata中发现，MRP3的等位基因特异性高甲基化使其表达沉默，从而决定性别：在MT^?中，两个等位基因均高甲基化，基因不表达；在MT⁺中，一个低甲基化等位基因确保表达，驱动性别决定。该甲基化模式在整个营养周期中维持，但MRP3表达仅在达到SST的MT⁺细胞中激活。长读长测序改进了MT决定区域的解析，揭示了一个基因贫乏、重复序列丰富的原始性决定区域，并在不同等位基因中观察到结构变异。甲基化抑制实验导致MRP3去甲基化、表达上调及部分性逆转，表明DNA甲基化在性别决定机制中发挥主动作用。研究结果还提示，硅藻中DNA甲基化的功能比单纯沉默重复区域更为复杂，为进一步研究其调控作用提供了依据。