《SCIENCE ADVANCES》：Expanded GEP-NET organoid culture for personalized therapy evaluation
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胃肠胰神经内分泌肿瘤（Gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs）是一组罕见的癌症亚型，发病率呈上升趋势。由于其生长缓慢且缺乏可靶向的突变，有效治疗方案的确定仍十分有限。造成这一停滞的原因之
胃肠胰神经内分泌肿瘤（Gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs）是一组罕见的癌症亚型，发病率呈上升趋势。由于其生长缓慢且缺乏可靶向的突变，有效治疗方案的确定仍十分有限。造成这一停滞的原因之一是缺乏适用且准确的研究模型。一种解决方案是能够维持肿瘤特征并可规模化用于高通量检测的患者肿瘤类器官（Patient tumor organoids, PTOs）。在本研究中，研究人员从17例患者获得的35例胰腺、小肠和胃部起源的肿瘤中生成了PTOs。重要的亚型包括激素功能性和MEN1/VHL突变的GEP-NETs，每种均在培养中表现出生长能力，同时维持了GEP-NET免疫组织化学和基因组特征。半数G2/G3肿瘤（20例中的10例）可培养超过第6代（passage 6），而G1肿瘤（n = 15）能够生长至第4代（passage 4）。对PTOs的治疗靶向显示，其对标准治疗和在研治疗表现出基于组织起源和分级的反应，同时维持了患者肿瘤的敏感性和耐药性。最后，研究人员从一条PTO细胞系成功建立了PTO异种移植（Xenograft）模型。本研究描述了GEP-NET类器官的开发，证明了其扩增的可行性，使其可用于转化研究。
本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。胃肠胰神经内分泌肿瘤（Gastro-entero-pancreatic neuroendocrine tumors, GEP-NETs）是起源于胃肠道包括胰腺、胃和肠的罕见内分泌癌症亚群，合并发病率为每10万人5.45例，过去四十年上升了五倍。目前GEP-NETs的治疗选择和序贯方案常基于多学科评估，但对于转移性疾病和高分级（Grade）肿瘤往往效果不佳，生存结局差。其肿瘤突变负荷（Tumor mutational burden, TMB）极低，缺乏如RAS或MYC等可靶向的驱动突变，常见突变为MEN1、DAXX、P53、CDKN1B和ATRX等肿瘤抑制基因，且免疫检查点抑制剂疗效低。表面生长抑素受体（Somatostatin receptors, SSTRs）表达与分级呈负相关，亟需新疗法。识别有效疗法的困难在于缺乏可重复的体外和体内实验疾病模型，传统细胞系多代表神经内分泌癌（Neuroendocrine carcinomas, NECs），动物模型差异大且患者来源异种移植（Patient-derived xenografts, PDXs）成功率约10%，成本高昂。三维非动物模型如患者肿瘤类器官（Patient tumor organoids, PTOs）虽具优势，但GEP-NETs因惰性生长导致传代率低，难以满足CRISPR-Cas9基因编辑、超高通量筛选等复制性研究需求。为此，研究人员开发了一种源自高分化GEP-NET肿瘤的类器官培养方法，假设GEP-NET PTOs能展示临床相关的治疗反应并保持保真度，以探索其在个性化医学中的潜力。
研究人员开展本研究用到的主要关键技术方法包括基于2023年3月至12月从17例患者中获取的35例肿瘤（胰腺、小肠、胃起源）建立类器官库，利用神经内分泌免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）标记和全基因组测序（Whole-genome sequencing）验证表型与基因组特征，应用CellTiter Glo 3D检测评估代谢活性与生长，采用包含标准治疗及在研药物的面板进行96小时药理治疗干预并计算半数抑制浓度（Median inhibitory concentration, IC50），以及将传代类器官皮下植入免疫受损非肥胖糖尿病（Nonobese diabetic, NOD） scid gamma（NSG）小鼠以建立PTO异种移植（PTOX）模型并进行短串联重复（Short tandem repeat, STR）测序与遗传指纹分析。
RESULTS
Establishment of GEP-NET organoid culture
研究人员从17例患者获取35例肿瘤，包括22例胰腺神经内分泌肿瘤（Pancreatic neuroendocrine tumors, PNETs）、11例小肠神经内分泌肿瘤（Small intestinal neuroendocrine tumors, SINETs）和2例胃神经内分泌肿瘤（Gastric neuroendocrine tumor, GASNET）。涵盖功能性、非功能性（Nonfunctional, NF）、MEN1胚系突变、VHL胚系突变及体细胞MEN1突变，分级包括G1（15例）、G2（15例）、G3（5例）。由此建立了多样化的GEP-NET PTOs实验流程。
PTOs retain growth and viability over multiple passages
类器官长期研究的效用取决于其在多代间可重复且准确的培养能力。研究发现PTOs在培养中形成大细胞簇，G2/G3肿瘤中50%（10/20）能培养超过passage 6，而G1肿瘤（n=15）无一超过passage 4，最高至passage 4。高级别PTOs在第14天显示出更高的平均活力值（P = 0.06）。传代时间因分级（P < 0.001）、既往NET病史（P = 0.01）、术后1年内进展（P < 0.001）及MEN1突变状态（P < 0.001）而异，G1进展至passage 2和passage 3慢于G2和G3。复发肿瘤的类器官生长快于初诊肿瘤，仅1例初诊G3达passage 6，而71.4%的复发肿瘤达此代次。
PTOs resemble NET morphology
使用神经内分泌IHC标记评估，PTOs表达嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A）、突触素（Synaptophysin）并维持SSTR2表面表达，与原发肿瘤组织匹配。Ki67有丝分裂增殖率比较显示，10/15（67%）的PTOs与原发组织分级一致，其余存在部分偏差可能源于采样差异。传代后PTOs在G1至passage 3及G1/G2至passage 6维持相似分级。
PTOs are representative of NET tissue mutational profile
通过全基因组测序对比患者胚系DNA，确认PTOs维持原发组织突变。45%（5/11）肿瘤/类器官对突变变化≤1，平均每个类器官系3.8次变化。最常见突变为CDKN1B改变（45%），其次为DAXX、MUC4、SETD2、DMD。传代间最常获得MUC4突变（36%），SETD2在4/11对中丢失。82%的PTOs TMB增加。克隆群体分析显示维持多克隆亚群，存在预期的克隆选择演化。
Therapeutic interrogation demonstrates origin, grade, and personalized PTO treatment responses
使用标准及在研疗法面板筛查，PNET类器官对卡博替尼（Cabozantinib, P = 0.009）、帕唑帕尼（Pazopanib, P = 0.04）和Belzutifan（P = 0.02）反应优于SINET。高级别（G2/G3）对化疗更敏感，如G1对链脲佐菌素（Streptozocin）反应低于G2（P < 0.01），对依托泊苷+顺铂（Cisplatin:etoposide）等亦然。NF肿瘤、既往NET史、MEN1突变状态均显示特定药物敏感性增加。约64%的后期传代PTOs治疗反应与原代（passage 0）在1倍log2差异内，83%在2倍内，显示一致性。个案中GASNET1对舒尼替尼（Sunitinib）耐药与临床吻合，VHL突变PNET对Belzutifan敏感。
PTOs can be used to develop stable PTOX
为模拟机体水平反应，研究人员将GASNET1A（p.6）皮下植入NSG小鼠建立PTOX。123天后检出肿瘤，传至第二代。瘤体染色嗜铬粒蛋白A阳性、突触素强阳性、SSTR2无表达，维持G3状态。STR测序（100%匹配）和遗传指纹（对数优势比Logarithm of the odds, LOD >1072）确认同源。基因组维持SMAD4、DMD、RPL11等高发突变，维持细胞群多样性。
DISCUSSION
讨论部分指出GEP-NETs研究不足且模型匮乏。本研究首次在长期使用患者来源GEP-NET类器官中建立并测试了多种药理制剂，覆盖多起源、转移灶和分级。既往报告生成PTOs成功率低（<25%过passage 1且限于G2/G3），本研究半数G2/G3达passage 6，允许用于CRISPR及高通量筛选。PTOs维持了嗜铬粒蛋白A、形态及分级，少数分级差异源于组织采样。突变维持方面，CDKN1B最常见，传代获MUC4失SETD2/DAXX，但未伴随80%以上治疗敏感性偏移。PTOs可在数周内预测治疗反应，符合临床分级治疗范式（G3首选化疗）。个案耐药（如Sunitinib）与临床进程相关，同患者多病灶差异可指导临床。PTOs局限在于缺全身反应，PTOX成功率通常<10%，本研究成功建立稳定PTOX维持标志物。不足在于仅至passage 6，G1未能过passage 4，低级别DAXX等突变丢失，新突变意义待查。总之，研究证明了长期培养GEP-NET PTOs的可行性，为其用于精准治疗筛查提供了依据，未来需优化低级别肿瘤生长。
结论翻译
总之，研究人员展示了培养患者来源的GEP-NET肿瘤类器官长期培养的稳健可行性，使其能够进行极高成功率的治疗筛查。因此，未来的优化工作应优先考虑低分级肿瘤的长期、可重复生长。
