负载并不等于递送：细胞内药物滞留与迁移能力决定巨噬细胞介导的药物递送

《SCIENCE ADVANCES》：Loading is not delivering: Intracellular drug retention and migration capacity govern macrophage-based drug delivery

　　

活细胞因具有主动靶向能力而日益被探索为药物载体，然而，体外稳健的细胞内装载往往难以转化为体内疗效。该研究通过将纳米药物与微米药物以相同细胞内质量并匹配的释放动力学装载于巨噬细胞中，解析了这种脱节现象。定量追踪显示，体外滞留会高估体内稳定性：纳米药物负载巨噬细胞在回输后丢失其载荷的比例最高可达83%，几乎是体外观察到丢失水平的两倍。纳米药物装载还会升高巨噬细胞内氧化应激，从而损害其趋化迁移能力。相比之下，微米药物可在细胞内持续存在≥7天，并保留巨噬细胞向炎症部位迁移的能力。借助活体显微成像（intravital imaging），该研究提供了此前缺乏的、在保留载荷的同时发生血管跨内皮迁移的时空证据。这些特性进一步转化为在全身性及局部炎症模型中的更优疗效。研究结果强调，有效的细胞基药物递送不仅需要关注摄取，还必须评估载荷在体内的持续性及其对细胞迁移的影响。

本文发表于《SCIENCE ADVANCES》，围绕细胞基药物递送系统（CDDS）中长期存在的“体外高装载并不等于体内高递送”这一关键转化瓶颈展开系统研究。研究背景在于，巨噬细胞等活细胞因具备炎症归巢、跨血管迁移和免疫调节等能力，被视为极具潜力的递药载体。但既往研究多以体外摄取效率作为递送能力的替代指标，忽视了两个决定体内真实递送成败的核心条件，即药物在载体细胞内的持续滞留能力，以及载药后细胞是否仍保有迁移至病灶的能力。因此，即便药物在体外能够被细胞高效吞噬，进入体内后仍可能因过早胞吐或迁移受损而无法实现有效治疗。正是由于这一领域缺乏将体外装载、体内命运与治疗结果贯通起来的定量证据，研究人员开展了本项工作。

研究人员构建了粒径均一的纳米与微米颗粒体系，分别代表纳米药物与微米药物两类负载形式，并通过严格控制使不同组巨噬细胞获得等量细胞内载荷，再比较其在体外与体内的滞留差异、对巨噬细胞趋化迁移的影响及最终治疗效果。研究显示，决定巨噬细胞递药效果的不是“能装进去多少”，而是“能在体内留多久、细胞还能不能迁移”。纳米药物虽然能够被高效装载，但在体内更易发生快速胞吐，且会诱导活性氧（ROS，reactive oxygen species）积累，干扰JAK-STAT与PI3K-Akt等迁移相关信号通路，削弱巨噬细胞黏附、趋化与跨内皮迁移能力。相反，微米药物可长期稳定滞留于细胞内，不明显损伤迁移功能，因而在全身性炎症与炎症性肠病模型中均表现出更优的递送保真性与治疗效果。该研究的重要意义在于重塑了CDDS的设计原则：评价细胞递药系统不应只停留在摄取效率层面，而必须同步考察体内滞留与功能保真，提出了“load once, deliver fully”的微米药物工程化策略。

主要技术方法方面，研究人员首先利用微流控（microfluidics）制备单分散聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，poly）颗粒和地塞米松棕榈酸酯（DexP，dexamethasone palmitate）颗粒，并在小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs，bone marrow-derived macrophages）中建立等质量装载模型；随后结合流式细胞术、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、活体荧光成像（IVIS）、活体显微成像、体相RNA测序（bulk RNA-seq）、定量PCR、Western blot及液相色谱-质谱（LC-MS）等方法，分别在全身性炎症、小鼠耳部炎症、骨骼肌局部炎症及右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病模型中分析载荷滞留、细胞迁移、组织归巢与治疗结局。动物来源包括BALB/c和C57BL/6小鼠。

在研究结果部分，论文首先以“Intracellular drug loading in vitro does not guarantee stable retention in vivo”为题，证明体外细胞内装载并不能保证体内稳定滞留。研究人员制备了粒径为0.2、1和3 μm的PLGA颗粒，并在等细胞内质量条件下比较其行为。结果显示，0.2 μm纳米颗粒在体外10小时内即有43.4%被排出，主要经溶酶体介导的胞吐途径；而3 μm微米颗粒在吞噬溶酶体中至少可稳定保留7天，几乎无明显外排。更重要的是，回输至炎症小鼠后，纳米颗粒的体内丢失显著高于体外估计：肺部聚集的负载巨噬细胞排出53.8 ± 2.7%的纳米载荷，肝脏中则高达83.2 ± 5.4%；相比之下，微米颗粒在肺和肝中均有超过85%仍保留于细胞内。组织切片也证实纳米颗粒多呈细胞外分布，而微米颗粒仍局限于载体巨噬细胞内。该部分说明，静态体外条件会系统性高估纳米药物在体内的稳定性。

第二部分“Stable intracellular drug persistence ensures accurate dosing and sustained macrophage anti-inflammatory function”聚焦稳定滞留如何转化为剂量准确性与抗炎功能。研究人员构建了0.2 μm和3 μm两种DexP颗粒，使其具有相同药物组成、相同细胞内负载量和相近释放动力学。结果表明，决定细胞内保留差异的关键是粒径而非材料。持续滞留的DexP微米颗粒可在无外源刺激及脂多糖（LPS）刺激下均更持久地促进巨噬细胞向M2表型极化，表现为CD206持续升高、CD80下降，并伴随IL-10增加、IL-6、TNF-α和IL-1β下降。在全身性炎症模型中，DexP3@MΦ组回收的肝脏巨噬细胞呈现更强M2极化，动物体重恢复更快，血清炎症因子下降更显著，肺、肝、脾器官指数接近健康对照。巨噬细胞清除实验进一步表明，其治疗效应依赖于回输巨噬细胞与内源巨噬细胞共同参与。

第三部分“Intracellular microdrugs do not interfere with the chemotactic migration ability of macrophages”讨论细胞内微米药物对迁移功能的影响。研究人员在transwell、静态与动态剪切力黏附模型中发现，负载1至3 μm颗粒的巨噬细胞其趋化迁移与炎症内皮黏附能力与未负载细胞相当，而负载0.2 μm纳米颗粒的巨噬细胞迁移能力下降超过50%，黏附能力也显著降低。在小鼠耳部炎症模型中，活体显微成像及三维重建进一步直接观察到负载微米颗粒的巨噬细胞从血管腔内穿越CD31标记的血管内皮进入血管周围组织，且迁移过程中颗粒始终与细胞共定位，证明微米载荷不会阻断跨内皮迁移。在骨骼肌局部炎症模型中，PLGA3@MΦ与空白MΦ均能有效归巢炎症肌肉，而PLGA0.2@MΦ信号明显较弱；流式结果显示，前两组靶向效率约为10%，纳米组仅约5%。这部分明确指出，在等载荷条件下，药物尺寸是决定载体细胞是否保留迁移能力的关键变量。

第四部分“Nanodrugs impair macrophage migration by disrupting cytoskeletal homeostasis via intracellular ROS accumulation”进一步解析纳米药物损伤迁移能力的分子机制。RNA测序显示，纳米颗粒主要改变氧化应激、炎症反应及肌动蛋白细胞骨架重塑相关基因集。细胞实验进一步证实，纳米颗粒负载巨噬细胞内ROS显著升高，而微米颗粒组维持基线水平；伴随F-actin聚合增强，提示细胞骨架稳态失衡。KEGG分析显示JAK-STAT、PI3K-Akt及细胞黏附相关通路受到抑制。qPCR和蛋白分析表明，SOCS3上调4.1倍，PUMA升高，BCL2L1下调；关键迁移分子CXCR4下降80%，ITGB1下降60%，MMP9下降92.7%，而与收缩张力相关的MYL9上调3.74倍。Western blot证实P-Akt与MMP9蛋白下调，流式证实表面CXCR4与ITGB1降低。进一步使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除ROS后，CXCR4和ITGB1表达及趋化迁移能力均得到部分恢复，说明ROS并非伴随现象，而是介导纳米颗粒致迁移障碍的重要功能性因子。

第五部分“Efficient macrophage homing enables faithful drug delivery and inflammation resolution”将迁移保真与治疗结局联系起来。在DSS诱导的炎症性肠病模型中，DexP3@MΦ在24小时内于结肠的聚集程度与空白MΦ相近，且较DexP0.2@MΦ高约30%。组织匀浆及LC-MS定量显示，DexP3@MΦ组结肠内DexP含量是DexP0.2@MΦ组的8.64倍，尽管同一时点游离Dex总量差异不显著。治疗上，DexP3@MΦ组体重恢复、疾病活动指数（DAI）、结肠长度、CD206⁺/CD80⁺巨噬细胞比例、组织炎症因子谱以及病理学损伤均优于DexP0.2@MΦ组。与单独给予DexP3微粒相比，DexP3@MΦ在多项终点上同样表现出更强疗效，提示治疗获益依赖巨噬细胞介导的主动递送，而不能由颗粒被动释放单独解释。

讨论部分指出，本研究以严格等载荷设计系统揭示了CDDS中“装载—递送脱节”的两大根源：一是药物在体内无法稳定保留于载体细胞内，二是载药过程本身可损害载体细胞迁移。研究人员认为，体外环境缺少系统稀释、器官吞噬汇、血流动力学应力及细胞外基质阻力等因素，因此体外滞留往往高估体内剂量保真度。纳米颗粒更易被胞吐，并诱导氧化应激和迁移信号重编程；微米颗粒则因在吞噬溶酶体中的“生物学不活动性”而长期存在，且不破坏细胞跨血管与组织归巢能力。研究还强调，回输的巨噬细胞并非被动“药库”，而是能够与内源免疫细胞协同调节局部免疫微环境的活性治疗单元。

研究结论可概括为：细胞基药物递送系统中，体外装载量并不能代表体内有效递送量；真正决定递送保真性与治疗成效的，是细胞内药物滞留和载体细胞迁移这两个前提条件。微米药物工程通过同时实现长期细胞内保留与归巢功能保真，建立了“单次装载、充分递送”的策略，从而实现更准确的细胞内给药、更稳定的炎症靶向和更优的治疗效果。更广泛地说，该研究推动CDDS设计理念从单纯追求摄取效率，转向综合考虑细胞内命运与细胞功能保留，为可编程免疫细胞治疗的精准化、安全性与通用性提供了机制基础。