《SCIENCE ADVANCES》：The melanocytic transcriptomic state is independently associated with poor overall survival in patients with metastatic melanoma
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黑色素瘤表现出不同的转录组状态，但目前尚不清楚它们如何与临床结果相关。研究人员对患者的转移性肿瘤进行了数字空间RNA谱分析（DSP-RNA），以调查转录组状态如何与黑色素瘤特异性生存期（MSS）和肢端黑色素瘤（AM）相关联。研究人员对组织微阵列进行了DSP-R
黑色素瘤表现出不同的转录组状态，但目前尚不清楚它们如何与临床结果相关。研究人员对患者的转移性肿瘤进行了数字空间RNA谱分析（DSP-RNA），以调查转录组状态如何与黑色素瘤特异性生存期（MSS）和肢端黑色素瘤（AM）相关联。研究人员对组织微阵列进行了DSP-RNA分析，该微阵列由1990年至2020年间诊断的111名中途转移性黑色素瘤（ITM）患者的组织构建而成。经过数据质量控制、噪声校正和标准化处理，研究人员从105名患者中获得了高质量的谱图，其中包括30名（36%）接受过免疫检查点抑制剂治疗的患者和20名（24%）患有AM的患者。研究人员进行了主成分（PC）分析，并将结果与已发表的基因签名进行了关联：PC1轴区分了过渡期和未分化的黑色素瘤，PC2反映了免疫细胞浸润，PC3对应于基质细胞和神经嵴样黑色素瘤，PC4与黑色素细胞性黑色素瘤相关。在接受过初始治疗（未接受过免疫检查点抑制剂等系统治疗）的ITM队列中，黑色素细胞状态的高表达导致了7.72年的中位MSS差异（黑色素细胞“高”组=5.16年，而“低”组=12.88年，log-rank P = 0.0061），并在多变量分析中与较差的生存期独立相关。与非肢端黑色素瘤相比，AM显示出更高的黑色素细胞状态基因表达。研究结果在外部数据集中得到了验证，支持了黑色素细胞状态可预测不良预后的结论。黑色素细胞状态与不良预后相关，并且可能在AM中更为富集，这意味着鉴定黑色素细胞性黑色素瘤患者对于治疗决策可能很重要。与其他用于预后分层的基因表达预测因子不同，黑色素细胞状态表征了一种生物学亚型，表明它可能具有特定的治疗脆弱性。
晚期皮肤黑色素瘤患者的临床结局存在巨大差异，即使处于相同临床分期的患者也是如此。目前以分期系统为基础的临床实践虽是风险评估的基石，却未能完全解释患者潜在的生物学变异性，因而难以充分应对晚期黑色素瘤的异质性。虽然基因表达谱（GEP）被越来越多地应用于风险评估，但既往提出的预后基因特征缺乏稳健的验证，且易受混杂因素影响。同时，恶性黑色素瘤细胞可被分类为不同的转录组状态，如未分化、神经嵴样、过渡性和黑色素细胞状态，但这些状态的生物学和临床重要性尚不明确。尤其在临床进展和生存模式高度异质的中途转移性黑色素瘤（ITM）以及肢端黑色素瘤（AM）中，转录组亚型的预后潜力未被充分探索。为解决上述问题，研究人员对来自111名ITM患者的组织微阵列（TMA）样本进行了全转录组数字空间RNA谱分析（DSP-RNA）。研究得出结论，黑色素细胞转录组状态与黑色素瘤特异性生存期（MSS）较差独立相关，并揭示了该状态在AM中显著富集。该研究将生物学亚型与临床结局相联系，为辅助临床治疗决策提供了潜在的分子标志物。本研究论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法开展研究：利用Nanostring GeoMx DSP平台对来自Duke大学医学中心的ITM患者组织微阵列进行全转录组空间测序（样本队列构建时间为1990年至2020年）；利用主成分分析（PCA）识别并提取主导基因表达变异的转录组状态特征；利用基因集变异分析（GSVA）和基因集富集分析（GSEA）对已发表的黑色素瘤基因集进行注释和关联分析；通过CIBERSORTx和MCPcounter对微环境进行细胞去卷积分析；并使用TCGA_bulk RNA-seq、外部DSP-RNA及单细胞RNA测序数据集对结论进行跨平台验证。
ITM的数字空间谱分析
研究人员构建了包含111名ITM患者共189个组织样本的TMA，并在6张GeoMx DSP玻片上进行了全转录组空间图谱分析。经过严格的数据质量控制、背景噪声校正和归一化处理，最终从105名独立患者的高质量数据中保留了170个感兴趣区域用于后续分析。
黑色素生成和肿瘤免疫与转移性黑色素瘤患者OS相关
在初步分析中，研究人员根据总生存期（OS）将患者分层为预后较差和预后良好两组。差异表达（DE）分析显示，虽然无基因达到显著性差异标准，但与黑色素素生成相关的基因在预后较差患者中表现出最为显著的差异表达。基因集富集分析发现，黑色素细胞状态、皮肤色素沉着及MITF表达相关的基因集与不良预后显著相关，而肿瘤免疫相关基因集则预示良好预后。
黑色素瘤转录状态的无监督鉴定
研究人员通过PCA进一步探索基因表达与OS之间的关联。分析表明，PC1（PC1-Transitory-Undifferentiated）能够区分过渡型和未分化黑色素瘤；PC2（PC2-Immune）反映了免疫微环境的浸润状态，能够有效区分“热”肿瘤与“冷”肿瘤；PC3（PC3-Stroma-Neural-Crest）对应于基质细胞和神经嵴/AP2样黑色素瘤；PC4（PC4-Melanocytic）则与黑色素细胞状态特征高度相关。由于PC4轴的基因表达特征能够独立于PC2（免疫基因）对样本进行分层，提示黑色素细胞基因表达可能独立预测不良预后。
使用分段的DSP-RNA数据验证无监督分析
为验证这些PC轴是否源自肿瘤细胞，研究人员将包含S100B、CD68和CD45标记分段的第三方DSP-RNA数据投影至当前PCA轴上，证实PC1和PC4表达模式主要来源于恶性细胞。同时，利用CIBERSORTx和MCPcounter进行的去卷积分析表明，PC1与肿瘤纯度强相关，PC3与基质浸润相关，而PC4-Melanocytic与恶性、免疫或基质分数仅有微弱关联，进一步证实其独立预测特性。
从PCA中提取黑色素瘤基因特征
研究人员通过提取对每个PC正负轴贡献最大的非冗余基因，生成了新的基因集，超几何检验表明这些新基因集与已发表的黑色素瘤状态特征存在显著重叠。
构建ITM黑色素瘤生存队列并探索基因特征与OS的关联
研究人员纳入84名未接受初始系统治疗的ITM患者的原发中途转移病灶以探索预后价值。生存分析显示，PC4-Melanocytic高表达导致中位MSS存在7.72年的差距，且独立与较差预后相关；PC2-Immune高表达与改善的MSS相关；PC1-Transitory-Undifferentiated低表达也与MSS改善相关。多因素Cox回归模型进一步证实，在调整ICI治疗及其他临床变量后，PC4-Melanocytic仍为影响MSS的独立危险因素。
黑色素细胞性黑色素瘤与临床变量的关联
研究队列包含24%的AM患者。虽然AM与非AM患者MSS无显著差异，但在GSEA比较中发现，AM中黑色素细胞基因集（包括PC4-Melanocytic、TSOI_MELANOCYTIC和BALDERSON_MELANOCYTIC）显著富集。同时，PC3-Stroma-Neural-Crest特征在AM中也表现出比PC4更为显著的富集。
黑色素细胞亚型和不良预后之间关联的验证
研究人员在TCGA_SKCM数据集（包含358个转移性黑色素瘤样本）中验证了预后价值，证实PC4-Melanocytic-high患者的OS显著差于low患者，并且在众多已发表的特征中表现出最高的风险比。在外部空间转录组数据集中，PC4-Melanocytic阳性特征在外生性和侵袭性黑色素瘤中高度富集，提示该特征可能与侵袭性表型相关。此外，利用独立单细胞测序数据集，证实该特征确实特异性地富集于恶性肿瘤细胞中。
讨论部分指出，研究人员生成了来自ITM患者的全转录组图谱，成功将转移性黑色素瘤的生存变异与转录组模式联系起来，提出了一种稳健的预后生物标志物。研究者们通过对TCGA和多个独立数据集的验证，确认了高黑色素细胞基因表达与较差生存期之间存在紧密关联。与其他用于预后分层的基因表达预测因子不同，黑色素细胞状态定义了一种明确的生物学亚型，暗示该亚型可能具有特定的治疗脆弱性。此外，AM相对于非AM表现出黑色素细胞基因表达的高度富集，这为理解该临床亚型的生物学特性提供了新视角。总而言之，黑色素细胞状态与黑色素瘤特异性生存期较差独立相关。估算黑色素细胞表达的程度可能对临床决策具有指导意义，例如在何时提供局部区域治疗以避免免疫检查点抑制剂带来的潜在毒性，弥补了传统病理学评估在预后分层中的不足。
