在单侧帕金森病模型中，对表达化学发光物质的间充质来源多巴胺能移植细胞进行多次刺激，可安全地增强游泳时肢体功能控制的恢复

《Behavioural Brain Research》：Multiple Stimulations of Chemoluminescent-Expressing Mesenchymal-Derived Dopaminergic Transplants Safely Reinforce Limb-Use Control Restoration During Swimming in a Unilateral Parkinson’s Disease Model

　　摘要：在帕金森病中，黑质致密部的多巴胺能神经元会逐渐退化，从而导致运动功能障碍。通过在大鼠的黑质纹状体通路中施加大量单侧多巴胺耗竭性损伤，并使用神经毒素6-羟基多巴胺，可以模拟这种退化过程。传统的L-多巴药物治疗虽然能改善行为症状，但通常无法恢复精细的肢体运动功能。在各种退行性疾病中，帕金森病由于仅有一种神经递质缺失，因此更易于实现有针对性的替代治疗。如果干细胞疗法能够成功融入宿主体内，那么它更有希望帮助恢复精细的肢体运动功能。我们认为，更为稳定且持久的帕金森病干细胞疗法需要借助主动引导或环境信号，在适宜的宿主环境中实现有效整合，从而确保其能够根据行为需求发挥调控作用。为探讨这一问题，我们研究了单独游泳锻炼、结合移植经改良的含LMO3的间充质干细胞衍生的多巴胺能细胞进行锻炼，以及在这两种情况下再辅以不同强度的与游泳相关的光遗传学刺激对移植细胞的作用。我们想了解，在早期整合阶段多次给予与行为相关的选择性刺激，是否有助于引导神经重构进程，从而在多巴胺缺失后更好地改善行为功能，同时避免产生不良后果。本研究通过记录大鼠的游泳任务，评估了锻炼、移植及刺激对前肢协同控制能力的提升效果。结果表明，结合移植细胞刺激与游泳锻炼，可在单次干预后促进移植细胞在前肢游泳过程中的协同作用，且两种不同的刺激方式相比单一刺激，既能更安全又能更有效地实现这一目标。

引言：帕金森病是一种进行性神经退行性疾病，其特征是黑质纹状体通路的退化，尤其是向新纹状体输送多巴胺的黑质致密部神经元数量减少。这会显著降低持续性和事件相关性的多巴胺信号传导，进而影响运动控制。帕金森病治疗的难点在于其往往在80%的多巴胺能神经元丧失后才被诊断出来，此时机体自身的代偿机制已接近极限。虽然震颤、动作迟缓、肌强直和步态不稳等明显症状最为突出，常规替代疗法虽可缓解这些症状，但对精细协调的运动控制功能却难以改善。目前的治疗方法如口服L-多巴和深部脑刺激虽能缓解症状，但也存在局限性。L-多巴缺乏时间与空间特异性，易导致耐药性和运动异常；而深部脑刺激虽对某些运动功能有效，但属于侵入性操作，且可能随时间失去效力，无法完全恢复正常的多巴胺信号传导。为克服这些局限，我们的实验室探索了将锻炼、干细胞疗法与对移植细胞的直接刺激相结合作为一种新的干预手段。由于帕金森病中某种特定类型的神经元缺失较为明确，因此特别适合采用干细胞移植治疗。我们实验室之前的研究表明，如果在锻炼期间对移植的干细胞进行刺激，而非在休息状态下，其带来的肢体功能恢复效果更为持久，这说明这种同步刺激有助于提高移植细胞的整合程度与功能。这一发现强调了联合刺激移植细胞的重要性，同时也表明锻炼有助于促进相关运动功能的恢复，而且这种刺激方式不仅能提升移植细胞的整合度，还能增强宿主系统的功能。这对于帕金森病的治疗研究具有重要意义，因为它为通过移植细胞提供适应性强的行为支持提供了可能路径——当移植细胞能被宿主有效调控时，便有可能以更精确的方式为背侧纹状体的运动处理神经元供应多巴胺。这些研究结果凸显出，为了实现更全面的机能恢复，需要精准控制多巴胺的释放时机与位置，而非像L-多巴那样持续供应。在运动规划过程中，通过有序整合移植细胞，或许能更好地实现多巴胺的释放调控。我们将移植细胞的刺激与主动运动相结合，旨在促使这些细胞更有效地融入宿主神经回路，从而助力目标导向的行为恢复及相应的肢体控制功能整合。我们的实验室主要研究间充质干细胞，尤其是骨髓来源的间充质干细胞，因为它们免疫原性低、伦理争议少，且经过体外分化后具有转染和转导能力，同时还具备产生多巴胺的潜力。我们的观察表明，经过适当分化、刺激和整合后，间充质干细胞移植不仅能为宿主体内残留的多巴胺能神经元提供营养支持，还具有成为多巴胺替代来源的巨大潜力。我们的假设是，这类干细胞移植的整合过程需要具有选择性和与行为相关的刺激。研究表明，利用化学遗传学激活的光遗传学技术来调控体内移植细胞，不仅能提高细胞的反应性与整合度，而且相比单独使用光刺激或化学物质刺激，缺点更少。光遗传学本身可以精准地按时间顺序激活目标神经元，但由于受限于局部光源的范围，无法照射到远离光源的细胞。而化学遗传学虽能系统性激活更多细胞，但缺乏时间精确性，且常用试剂可能存在脱靶效应。为同时实现时间精确性与较广泛的组织覆盖，本研究采用了化学光遗传学技术，让移植细胞表达光敏蛋白。这类光敏蛋白融合了荧光素酶单元、视蛋白单元和荧光标签，因此当这些表达光敏蛋白的移植细胞接触到催化剂coelenterazine时，荧光素酶会被激活并产生光信号，进而刺激视蛋白，从而精准且广泛地激活细胞，这一方式比单纯使用光遗传学更高效，同时也能避免传统化学遗传学试剂的缺陷。如果将这些移植细胞进一步培育成多巴胺能神经元，这种方法还能增强帕金森病模型中的多巴胺释放与行为恢复。虽然锻炼本身就能通过促进血管生成、神经可塑性及神经营养因子的增加来改善大脑健康，但我们认为，在移植后的早期阶段进行锻炼，对于促进移植细胞与宿主的整合以及整体功能恢复至关重要，因为这一时期正是神经元连接形成高峰期，适度的锻炼有助于依据赫布定律“一起放电的神经元会形成连接”来引导突触发育，同时创造更有利的宿主环境；而久坐不动则会限制功能恢复，这进一步凸显了在整合阶段进行针对性运动的必要性。我们认为，由骨髓间充质干细胞衍生的多巴胺能神经元在锻炼过程中受到刺激时，能够释放具有特定环境意义的信号，从而促进细胞整合与功能恢复。引入移植细胞后，便可利用这一新细胞群实现更精准的多巴胺释放调控，而这些细胞通常会被直接移植到背侧纹状体，因为在成年动物的大脑中，要让轴突在充满干扰因素的神经环境中延伸很长的距离极具难度，且还需要足够的轴突生长长度。尽管在啮齿类动物模型中，胚胎干细胞在黑质中的同源移植能够让轴突沿着重建的纹状体通路延伸，但由于这种延长后的轴突到达所需时间较长，因此难以在移植后的早期阶段有效调控细胞整合过程。在本研究中，我们选择了能产生多巴胺的骨髓间充质干细胞的异位移植，因为这类细胞能够在纹状体中形成类似的突触连接，能够延伸至纹状体内部，同时还能带来行为上的益处。实际上，绝大多数针对帕金森病患者的移植试验也采用类似的纹状体局部移植方案。即使在健康的动物体内，皮质纹状体传入纤维也能通过终端上的谷氨酸受体调控纹状体的持续性与阶段性多巴胺释放。相比之下，远端中枢神经系统区域的突触连接需要在发育过程中经历较长的轴突生长与引导过程，而皮质纹状体中的谷氨酸能传入纤维及局部GABA能神经元之间的相互作用早已存在于纹状体内部，只需在最后阶段通过赫布定律的“一起放电则形成连接”机制来强化宿主对运动的控制。在以往的研究基础上，我们设计了这项研究，旨在评估多次结合移植细胞刺激与与游泳相关的环境兴奋性刺激，是否比单一的刺激方式更能有效促进个体前肢功能的恢复。本研究旨在探讨单独锻炼、锻炼期间仅进行一次CTZ刺激，还是锻炼期间进行两次CTZ刺激，哪种方式最有利于实现移植细胞介导的精细肢体功能恢复。我们的假设是，与复杂锻炼相结合的适时刺激能促进多巴胺能移植细胞的最佳整合，这一结论可从行为表现中得到验证，而且多次进行此类刺激效果更佳，从而为优化和维持帕金森病治疗方案提供思路。虽然我们团队之前的研究已经证明，与行为相关的刺激能够增强移植细胞带来的恢复效果，但这些研究存在光源覆盖范围有限、使用胚胎干细胞作为移植来源，或缺乏适当的假移植对照组等问题。本研究的优势在于：首先，直接检测了在化学遗传学-光遗传学调控下的间充质干细胞衍生多巴胺能移植细胞的性能；其次，设置了接受相同刺激与锻炼条件的假移植对照组；第三，评估了重复刺激是否有助于或妨碍早期细胞整合。据我们所知，这是首项证明多次与行为相关的刺激能够在不降低治疗效果的情况下改善功能恢复的研究。

动物与研究设计：本研究采用了符合中央密歇根大学动物护理与使用委员会批准方案（编号2022-847-HP）的帕金森病大鼠体内模型。最初共有40只60-80天大的雄性Sprague-Dawley大鼠参与研究，其中21只因死亡或其他原因不符合研究标准而被排除。所有大鼠均被饲养在温度可控、采用昼夜逆转周期的环境中。

ELISA检测：经分化后的LMO3-BMSCs在分化早期就表现出释放多巴胺的能力。在正常条件下，多巴胺浓度较低，但加入50 mM钾离子后，多巴胺的释放量显著增加（t(3) = 4.294，p =.03；见图3）。这表明这些细胞不仅具有多巴胺能表型，还具备囊泡释放功能。尽管我们也研究了其他类型的刺激作用，但此处不再详述。

讨论：对移植细胞进行刺激，为运动和多巴胺释放提供相应环境信号，对于恢复患半侧帕金森病大鼠的对称性前肢功能而言至关重要。这一发现与我们之前的研究结果一致，但本研究更进一步，直接评估了多次与行为相关的刺激是否有助于或妨碍早期移植细胞的整合。我们推测，接受刺激的移植动物……

机构动物护理与使用委员会声明：本研究已获得中央密歇根大学动物护理与使用委员会的批准，项目编号为2022-847，批准日期为2022年5月25日（方案代码2022-847亦于2022年5月25日获得批准）。

未引用参考文献：[31]、[32]、[44]、[45]、[46]

CRediT作者贡献说明：Stefani M. Galik：撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析；Tommie L. Cammarano：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析；Gary L. Dunbar：撰写——审稿与编辑、资金获取；Sandstrom Michael Ian：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资源协调、项目管理、资金获取、数据整理、概念构思；Kevin A. Anderson：撰写——审稿……

利益冲突声明：无

致谢：本研究的顺利开展离不开Sandstrom实验室中各位本科生研究助理的辛勤付出。我们特别感谢Ashley Lueschen、Noah Bond和Katelyn Ernst，他们不仅在数据收集方面提供了帮助，还承担了实验室里的诸多日常任务，他们的贡献对我们而言意义重大。同时，我们也要感谢Gary Dunbar博士和Emily Bloesch博士作为本项目顾问所给予的指导。此外，我们还要感谢Sandstrom博士在整个研究过程中的大力支持。

Tommie L. Cammarano | Stefani M. Galik | Kevin A. Anderson | Emily Bloesch | Gary L. Dunbar | Michael I. Sandstrom
美国密歇根州Mt. Pleasant市，中央密歇根大学，实验心理学专业