黑色素与镁离子调控的可控粘附性光热凝胶对糖尿病伤口修复效果的研究

《Bioactive Materials》：Study on the repair effect of photothermal hydrogel with controllable adhesiveness regulated by melanin and magnesium ions on diabetic wounds

　　

慢性非愈合伤口，以病程长和修复潜力低下为特征，不仅导致患者遭受持续性躯体疼痛和日常生活能力受损，还容易诱发感染和截肢等严重并发症，对患者的健康和生活质量构成严重威胁。在该研究中，研究人员通过天然乌贼黑色素与壳聚糖衍生物（HPCS）之间的缩合反应，成功制备了具有优异光热性能的黑色素衍生物（M-HPCS）。随后，研究人员利用电荷相互作用，将M-HPCS与透明质酸衍生物（HA-PEG）组装，构建了具有可控粘附性能的光热凝胶（M-HPCS/HA-PEG）。该凝胶可通过螯合镁离子（Mg²⁺）进一步增强其自身粘附能力，使其适用于非愈合伤口的修复和治疗。结果表明，依赖于乌贼黑色素和Mg²⁺的双重调控作用，该凝胶可实现对伤口可控粘附和使用后的无创脱离。凝胶与光热治疗（PTT）的联合治疗通过有效调节慢性非愈合伤口微环境中的炎症水平，促进血管生成，加速上皮化过程，从而显著促进伤口愈合，展现出最优的修复效果。该光热凝胶对不同类型伤口具有理想的粘附适应性，并可通过热疗有效促进伤口修复。这项研究为慢性非愈合伤口的临床治疗提供了新的见解和技术支持。

慢性非愈合伤口（CRWs），如糖尿病性溃疡，因持续炎症、细菌生物膜、缺血缺氧和氧化应激等微环境失调而难以修复，传统治疗超60%病例无效。光热疗法（PTT）具有非侵入性与广谱抗菌优势，但需高效光热剂。乌贼黑色素（melanin）具高光热转换效率（>45%在900-1064 nm）和抗氧化性；水凝胶可为伤口提供湿润环境；镁离子（Mg²⁺）参与止血、炎症、增殖和重塑等多阶段调节。然而，现有材料难以实现伤口愈合过程中可调控的粘附性与无创去除。因此，该研究旨在构建一种通过黑色素和Mg²⁺双重调控粘附性的光热凝胶，用于糖尿病慢性伤口修复。该研究成功合成了黑色素衍生物（M-HPCS）和透明质酸衍生物（HA-PEG），通过电荷相互作用组装成M-HPCS/HA-PEG凝胶，并螯合Mg²⁺形成M-HPCS/HA-PEG+Mg²⁺。体外表征显示凝胶具有可控粘附性、光热性能、抗氧化和促细胞迁移、血管生成活性。在STZ诱导的糖尿病大鼠深二度烧伤模型（包括金黄色葡萄球菌感染模型）中，凝胶联合PTT显著促进伤口愈合，调节炎症（促进M1向M2巨噬细胞极化），增强血管新生（CD31和α-SMA表达），并加速上皮化。转录组分析揭示其机制涉及上调表皮发育相关KRT基因，下调NF-κB、TNF和MAPK炎症通路。该研究为慢性非愈合伤口治疗提供了新策略，论文发表在《Bioactive Materials》。

**关键技术方法**（≤250字）：主要方法包括：1）黑色素提取与M-HPCS合成（通过酰胺化反应将天然乌贼黑色素接枝于壳聚糖衍生物HPCS）；2）HA-PEG合成（通过EDC/NHS活化将PEG接枝于透明质酸）；3）凝胶制备（M-HPCS与HA-PEG混合，经温度响应凝胶化，并加入MgCl₂螯合）；4）材料表征（FTIR、1H NMR、SEM、TEM、流变学、粘附力测试、光热性能测试、DPPH/ABTS自由基清除实验）；5）体外细胞实验（MTT、活死染色、划痕迁移、成管实验、DCFH-DA ROS检测）；6）动物模型（STZ诱导糖尿病SD大鼠，深二度烧伤模型；另设金黄色葡萄球菌感染模型）；7）组织学分析（H&E、Masson染色、CD206/iNOS/CD31/α-SMA免疫荧光）；8）转录组测序（RNA-seq，DEGs分析，KEGG/GO富集，GSEA）。

**研究结果**（保留小标题，简要说明结论）：

**3.1 黑色素、HPCS、M-HPCS和HA-PEG的制备与表征**：通过FTIR、1H NMR、UV-Vis、SEM/TEM、粒径与Zeta电位及元素分析，证实成功合成了M-HPCS（球形核壳结构，粒径约646 nm，Zeta电位+10.06 mV）和HA-PEG（PEG取代度45.23%）。

**3.2 M-HPCS/HA-PEG和M-HPCS/HA-PEG+Mg²⁺凝胶的凝胶化**：M-HPCS/HA-PEG混合物在60°C加热30 min可形成凝胶（除1:9比例）；加入Mg²⁺后，M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺凝胶化温度降至45°C，表明Mg²⁺通过螯合酚羟基稳定网络。

**3.3 流变学性质**：流变测试显示，所有凝胶的储能模量(G′)均大于损耗模量(G″)，呈弹性凝胶状态。M-HPCS₇/HA-PEG₃的G′最高（7492.75 Pa），表明高黑色素含量增加交联密度。M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺的G′为938.7 Pa，且能承受更高应变（>761%），韧性优异。

**3.4 微观结构**：SEM显示，M-HPCS₃/HA-PEG₇、M-HPCS₁/HA-PEG₁、M-HPCS₇/HA-PEG₃平均孔径分别为435.26、191.22、128.04 μm，黑色素含量增加使孔径减小、结构更致密。加入Mg²⁺后，M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺孔径降至103.44 μm，交联更均匀。

**3.5 粘附性**：凝胶可牢固粘附于玻璃、猪皮等多种材料，剥离后无残留。定量测试显示，M-HPCS₇/HA-PEG₃粘附强度4.613 kPa，优于阳性对照。加入Mg²⁺后，M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺粘附强度升至6.701 kPa，而M-HPCS₇/HA-PEG₃+Mg²⁺降至2.562 kPa，表明Mg²⁺对粘附性的调控依赖于黑色素含量。

**3.6 溶胀性能**：溶胀率随黑色素含量增加而降低（M-HPCS₇/HA-PEG₃为26.94），加入Mg²⁺后进一步降低，但仍保持良好吸液能力。

**3.7 光热性能**：808 nm激光照射下，凝胶温度迅速升高，呈功率和时间依赖性，M-HPCS₇/HA-PEG₃在1 W/cm²下10 min达55.45°C。经5次开/关循环后温度稳定，光热稳定性良好。Mg²⁺对光热性能无显著影响。

**3.8 抗氧化性能**：DPPH和ABTS自由基清除实验表明，黑色素含量越高，抗氧化活性越强（M-HPCS₇/HA-PEG₃的DPPH清除率77.16%）。加入Mg²⁺后清除率进一步提高（84.10%-85.26%）。

**3.9 细胞相容性**：MTT实验显示，M-HPCS₇/HA-PEG₃和M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺提取液对L929细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的存活率均>80%，无细胞毒性。

**3.10 细胞迁移实验**：划痕实验显示，两种凝胶提取液均显著促进L929和HUVECs迁移，36 h后迁移率分别达90%（HUVECs）和50%（L929），显著高于对照组。

**3.11 活/死细胞染色**：Calcein-AM/PI染色显示，培养1、3、5、7天后，凝胶组细胞数量增加，形态正常，无死细胞，表明凝胶促进细胞增殖。

**3.12 血管生成实验**：Matrigel成管实验显示，凝胶组在8 h形成明显管状结构，节点数和管长度约为对照组的2倍，证实促血管生成作用。

**3.13 抗氧化能力分析**：500 μM H₂O₂诱导氧化损伤后，凝胶提取液将L929细胞活力从67.36%恢复至94.71%-107.67%，M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺效果更优；DCFH-DA荧光显示凝胶组ROS水平显著降低。

**3.14 伤口愈合观察**：糖尿病大鼠深二度烧伤模型中，凝胶组伤口愈合进程优于空白和阳性对照组，特别是凝胶+近红外线（NIR）组在第28天完全愈合，皮肤恢复正常。

**3.15 伤口愈合率分析**：定量分析显示，M-HPCS₇/HA-PEG₃+NIR和M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺+NIR组在第14天愈合率分别达62.25%和63.75%，显著高于对照组（40.32%），第28天均达100%。

**3.16 体内光热转换**：凝胶+ NIR组在1.5 W/cm²照射5 min后，伤口温度达约50°C，适合光热治疗。

**3.17 粘附强度变化**：凝胶在伤口表面的粘附力随时间逐渐降低（0.5 h为7.034 kPa，6 h为2.589 kPa），有利于早期密封和后期无创去除。

**3.18 伤口组织病理学分析**：H&E和Masson染色显示，凝胶组在第14天出现新生表皮和毛细血管，第21天胶原有序排列，第28天完全愈合，表皮分化正常，附属器再生。M-HPCS₃/HA-PEG₇+Mg²⁺组上皮厚度和胶原面积百分比最高。免疫荧光显示，凝胶组iNOS表达降低（M1巨噬细胞减少），CD206表达升高（M2巨噬细胞增加），且NIR增强此效应，促进巨噬细胞极化。CD31和α-SMA荧光增强，表明血管新生和成熟。

**3.19 体内光热抗菌与愈合效果**：在金黄色葡萄球菌感染糖尿病烧伤模型中，凝胶+ NIR组显著减少细菌负荷，伤口愈合速度加快，第14天愈合率约87%，优于单独凝胶组和对照组。

**3.20 转录组分析**：RNA-seq共鉴定1914个差异表达基因（DEGs），其中570个上调、1344个下调。上调DEGs富集于细胞粘附、增殖和组织再生通路（Hippo、Rap1、Wnt、PI3K-Akt），包括KRT家族基因（Krt1,5,10,14,16）和胶原基因（Col1a2, Col6a5, Col6a6）。下调DEGs富集于炎症通路（NF-κB、TNF、MAPK、TGF-β），包括Nfkbia、Il1b、Tnfrsf1a等。基因集富集分析（GSEA）进一步证实NF-κB、MAPK、TGF-β通路被抑制。表明凝胶联合PTT通过促进表皮发育和抑制炎症信号通路加速伤口愈合。

**3.21 生物相容性**：皮下和肌肉植入实验显示无红肿、坏死；H&E染色显示主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）结构正常；血清肝功能指标（ALT、AST、ALP）和尿素氮（BUN）正常；溶血率<3.35%，表明凝胶具有良好的生物安全性。

**总结讨论与结论**：该研究基于M-HPCS与HA-PEG之间的分子间氢键相互作用，构建了具有可控粘附性的多功能凝胶敷料。体外表征证实该凝胶具有优异的溶胀性、组织粘附性（随黑色素含量增加而增强）、抗氧化活性（DPPH清除率77.16%，ABTS清除率74.59%）和光热性能（1 W/cm²下最高温度55.45°C）。螯合Mg²⁺后，粘附性和抗氧化性进一步提高。细胞实验表明凝胶能促进L929和HUVECs增殖、迁移，并具有强促血管生成活性。糖尿病大鼠伤口修复实验证实凝胶可显著加速愈合，联合PTT效果更优，且对金黄色葡萄球菌感染伤口有效。组织学分析显示凝胶能有效调节炎症（促进M1向M2极化）、促进新生血管形成、肉芽组织增殖和上皮化。转录组分析揭示凝胶上调表皮发育相关KRT基因，下调NF-κB、TNF和MAPK炎症通路。体外和体内评价均证实其良好的生物安全性。该研究成功开发了一种可控粘附性的多功能生物活性凝胶敷料，可有效缓解慢性糖尿病伤口的炎症微环境和氧化应激，促进血管生成和皮肤组织再生，为临床治疗提供新的组合治疗策略。