靶向BCMA与B7?H3的双特异性蛋白衔接子武装T细胞克服多发性骨髓瘤抗原异质性

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Dual bispecific protein engager–armed T cells targeting BCMA and B7-H3 overcome antigen heterogeneity in multiple myeloma

　　

多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）仍是一种无法治愈的浆细胞恶性肿瘤，尽管治疗取得进展，大多数患者最终进展为复发或难治性MM（relapsed or refractory MM, RRMM）。抗原异质性与免疫逃逸，尤其是B细胞成熟抗原（B?cell maturation antigen, BCMA）的丢失，对有效免疫治疗构成主要挑战。值得注意的是，由TNFRSF17改变驱动的BCMA丢失发生在相当比例的RRMM中，从而限制了BCMA靶向治疗的持久性。与此同时，B7同源物H3（B7?homolog H3, B7?H3）在MM中频繁过表达，并被证实参与肿瘤进展、免疫逃逸及治疗抵抗。为应对抗原异质性，研究人员开发了针对BCMA和B7?H3的双靶向双特异性蛋白衔接子（bispecific protein engager, BiPE）武装T细胞（dual BATs）。双BATs通过同时用两种BiPEs——抗BCMA?×?抗CD3ε和抗B7?H3?×?抗CD3ε——武装T细胞而产生，这两种BiPEs被设计用于结合不同且不重叠的CD3ε表位。功能表征表明，双BATs在具有不同抗原表达谱的MM模型中介导了抗原特异性的T细胞活化、细胞因子分泌、增殖及细胞毒性。重要的是，双靶向拓宽了抗原识别而非增强固有细胞毒效力，其功能反应主要受抗原密度、各BiPE臂的结合特性以及CD3接合平衡所调控。综上，这些发现支持双BiPE武装T细胞作为一种灵活且适应性强的策略来克服抗原异质性，并强调了相对抗原表达水平在优化MM的T细胞重定向免疫治疗中的关键作用。

研究背景方面，多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种以骨髓内异常浆细胞克隆性扩增为特征的恶性肿瘤，目前仍难以治愈，大多数患者最终会进展为复发或难治性MM（relapsed or refractory MM, RRMM）。现有治疗虽包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物等，但仍面临耐药与复发的难题。近年来，靶向B细胞成熟抗原（B?cell maturation antigen, BCMA）的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR?T）与双特异性T细胞衔接子（bispecific T?cell engager, BiTE）等免疫治疗改善了部分RRMM患者预后，但抗原丢失尤其是TNFRSF17改变导致的BCMA缺失，成为治疗失败的重要机制。与此同时，B7同源物H3（B7?homolog H3, B7?H3，由CD276编码）在MM中常过表达，参与免疫逃逸与耐药，被视为补充靶点。为克服抗原异质性带来的抗原逃逸，研究人员提出并在本研究中开展双靶向双特异性蛋白衔接子（bispecific protein engager, BiPE）武装T细胞（armed T cells, BATs）的研究，即双BATs（dual BATs），通过同时用抗BCMA?×?抗CD3ε与抗B7?H3?×?抗CD3ε两种BiPEs武装原代T细胞，两种BiPEs结合CD3ε上不同且不重叠的表位，从而在单细胞水平实现双抗原识别。该研究发表于《Biomedicine》，旨在明确双BATs在MM异质性模型中的功能特征、信号调控及潜在优势，为优化T细胞重定向免疫治疗提供依据。

为开展本研究，研究人员主要从健康供者外周血获取原代T细胞，经密度梯度离心获得外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）并富集淋巴细胞；构建并生产稳定表达抗BCMA?×?抗CD3ε（SP34）与抗B7?H3?×?抗CD3ε（OKT3）BiPEs的HEK293T稳转细胞系以制备BiPEs；通过流式细胞术分析MM细胞系（NCI?H929、KMS?12?PE、SupT1、U937）表面BCMA与B7?H3表达；采用顺序孵育法生成单BATs与双BATs并评估结合效率；通过共培养体系评估T细胞活化（CD69、CD25）、耗竭标志物（PD?1、LAG?3、TIM?3、TIGIT）、增殖（CellTrace? CFSE稀释）、细胞毒性（CMFDA标记靶细胞与计数微珠定量）及细胞因子分泌（Cytokine Bead Array, CBA检测IFN?γ、TNF?α、IL?2、Granzyme B等）；所有实验均设重复并以合适统计学方法分析。

研究结果部分保留原文小标题并依内容简述如下：

3.1. BCMA and B7?H3 expression in multiple myeloma cell lines

研究人员通过流式细胞术、免疫荧光与免疫印迹验证所选MM细胞系抗原表达谱，发现NCI?H929为BCMA^High/B7?H3^Low，KMS?12?PE为BCMA^High/B7?H3^High，U937为BCMA^Low/B7?H3^High，SupT1为BCMA^{Very low}/B7?H3^{Very low}，为后续功能实验提供模型依据，证实BCMA与B7?H3在MM中呈部分重叠表达，适合作为双靶向抗原。

3.2. Generation of anti?BCMA × anti?CD3ε and anti?B7?H3 × anti?CD3ε BiPE?producing stable cell lines

研究人员构建携带RFP?T2A?BiPE与IRES?嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体，转导HEK293T并经筛选获得稳转株，经荧光显微镜、流式与免疫印迹验证RFP表达及BiPE在细胞裂解液与上清中的表达与分泌，证实平台可稳定规模化产生两种BiPEs。

3.3. Binding characterization of anti?BCMA × anti?CD3ε and anti?B7?H3 × anti?CD3ε BiPEs to T cells and target cells

通过免疫荧光与剂量依赖性流式结合实验，研究人员发现两种BiPEs均能特异性结合CD3ε与相应肿瘤抗原，抗B7?H3?×?抗CD3ε BiPE对CD3ε表观亲和力更高（BC₅₀?0.1198?ng vs 0.2668?ng），而抗BCMA?×?抗CD3ε BiPE对KMS?12?PE细胞上BCMA结合更强（BC₅₀?0.2688?ng vs B7?H3?0.6114?ng），说明两构造在CD3接合与抗原识别间平衡不同。

3.4. Generation of single and dual BiPE?armed T cells (BATs)

研究人员将未刺激T细胞分别用单一或两种BiPEs（各50?ng/mL）室温孵育并洗涤，流式检测His?tag与FLAG?tag显示单BATs结合率＞94%，双BATs对两种BiPEs结合率分别为95.51%与96.43%，无显著干扰；CFSE标记显示单、双BATs在共培养中均具持续增殖能力，证实双武装可行且不影响增殖。

3.5. Cytotoxic activity of single and dual BiPE?armed T cells (BATs)

在多种抗原表型靶细胞中，研究人员以不同效靶比（E:T?1:1、2.5:1、5:1）共培养12?h后定量杀伤。结果显示细胞毒性严格依赖抗原表达：NCI?H929主要靠抗BCMA BATs杀伤，U937靠抗B7?H3 BATs，KMS?12?PE中三者均强效杀伤，双BATs在低E:T下介于两单靶BAT之间，高E:T下趋近最大值；SupT1仅在最高E:T有轻微背景杀伤。双BATs未表现出协同增强，而是拓宽抗原识别覆盖。

3.6. Phenotypic characterization of single and dual BATs following cytotoxicity

研究人员在E:T?5:1共培养后检测发现，所有BATs均上调早期活化标志CD69，晚期CD25仅在抗原匹配靶细胞共培养时升高；耗竭标志PD?1、LAG?3、TIM?3在特定抗原背景下选择性上调，TIGIT无变化；CD4⁺多于CD8⁺，亚群以初始T细胞为主，双BATs未改变亚群分布；增殖分析显示抗原依赖性强于无靶对照。

3.7. Cytokine secretion profiles of single and dual BATs following target engagement

研究人员收集12?h共培养上清，CBA检测发现细胞因子分泌与细胞毒性趋势一致：NCI?H929共培养中抗BCMA与双BATs显著升高IFN?γ与Granzyme?B；U937中共培养中抗B7?H3与双BATs升高Granzyme?B、IFN?γ、IL?2、TNF?α；KMS?12?PE中抗BCMA BATs IFN?γ显著升高，双BATs次之；各条件下IL?6均低，提示BATs可能降低细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）风险。

讨论部分总结中，研究人员指出，尽管MM治疗进步，复发与难治仍受抗原异质性与BCMA丢失限制，多抗原靶向是应对策略。本研究通过双BATs证明，同时用结合不同CD3ε表位的BiPEs武装T细胞在结构上可行且无竞争排除，但功能上双CD3接合未必叠加，可能受信号竞争或空间干扰调节。功能反应由抗原密度、BiPE臂结合特性与CD3接合平衡共同决定；双BATs主要贡献是扩大抗原识别而非增强单个效应细胞毒力，在低抗原密度模型中双重接合甚至可能轻微干扰最优CD3信号。表型与细胞因子分析显示活化受抗原驱动，耗竭标志按需诱导，IL?6低支持安全性优势。研究人员进一步提出未来优化方向：谨慎选择CD3ε表位、亲和力学调整、共武装比例调控及引入共刺激（如CD28）以兼顾多抗原识别与效力。相较于三特异性衔接子、双CAR?T等，BATs为非基因改造、灵活组合的平台，可减少全身暴露与生产成本，但尚需体内与骨髓微环境模型验证。

结论部分翻译如下：

总之，研究人员开发并表征了靶向BCMA和B7?H3的双特异性蛋白衔接子武装T细胞（dual BATs），以应对多发性骨髓瘤中的抗原异质性。双BATs在具有不同抗原表达谱的肿瘤模型中介导了抗原特异性的T细胞活化、细胞因子产生及细胞毒性。功能反应主要受抗原特异性、抗原结合强度与CD3ε接合相对效力调控，细胞毒活性很大程度上由主导抗原轴决定。尽管双重CD3接合可能对信号产生一定调节，但总体T细胞功能得以保留。综上所述，双BATs主要在异质性MM模型中扩大了抗原覆盖范围，而非提高单个效应细胞的固有细胞毒效力。因此，双靶向的主要优势似乎在于更广泛的肿瘤识别与减轻抗原逃逸，而非T细胞功能的协同增强。