综述：肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），一种I型磷酸酶：血管张力的主要调节因子及心血管医学中新型治疗策略的诱人靶点

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Myosin light chain phosphatase (MLCP), a type I phosphatase: Key regulator of vascular tone and an attractive target for novel therapeutic strategies in cardiovascular medicine

　　

稳定的血管张力的维持对于缓冲血流以及重新分配血氧和葡萄糖以满足器官和组织代谢需求具有重要的功能意义。与其他由平滑肌细胞构成的空腔器官的张力一样，血管张力受肌球蛋白20-kDa调节轻链（MLC20）的可逆磷酸化控制，该过程由两种相反的酶调控：钙/钙调蛋白（Ca2+-CaM）激活的肌球蛋白轻链激酶（MLCK），它使MLC20磷酸化；以及肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP），它使MLC20去磷酸化。本综述总结了不同脑区和外周血管床中张力调节的关键方面，特别强调了酶肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）在生理和病理背景下的核心作用。研究人员提出，MLCP作为Ca2+依赖、RhoA/ROCK介导、环核苷酸依赖、氧化还原和缺氧敏感以及剪接变体控制的信号通路的中心分子整合器，共同决定血管张力。最后，研究人员讨论了旨在改善与MLCP功能障碍相关疾病管理的临床相关研究视角。

1. 1.
   肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）在血管张力调节中的关键作用
   血管的一个显著特征是持续收缩，这对于缓冲血流和重新分配血液以满足器官和组织的代谢需求至关重要。根据哈根-泊肃叶定律，血流量与血管半径的四次方成正比。因此，血管张力的微小变化（即血管半径的变化）可导致血液供应的巨大改变。与其他平滑肌类似，血管收缩受肌球蛋白20-kDa调节轻链（MLC₂₀）的可逆磷酸化调控。该过程由两种相反酶控制：钙/钙调蛋白（Ca²⁺-CaM）激活的肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）。大多数诱导血管收缩或舒张的激动剂通过改变这两种酶的活性来发挥作用。历史上，研究主要集中于MLCK，但现已确定，即使细胞内Ca²⁺浓度恒定，收缩力也可升高，这种现象称为Ca²⁺增敏，反映了MLCP活性的改变。
2. 2.
   肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）：结构、功能和调节
   MLCP是一种I型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。其催化活性位于38-kDa的蛋白磷酸酶1催化亚基（PP1c）中，该亚基存在四种异构体（α、β、γ和δ）。尽管广泛表达，MLCP主要被认为是平滑肌收缩性的重要调节因子。PP1c介导的过程的一个关键特征是其形成特定蛋白质-蛋白质相互作用的能力，这些相互作用不仅将MLCP重定向到特定底物，还根据其实验条件将其催化效率提高1.7至2.6倍。
3. 3.
   PP1cδ催化活性通过结合伴侣的调节
   3.1 通过中央区域调节MLCP：MYPT1磷酸化的作用
   MLCP是由三个亚基组成的三聚体全酶：催化亚基PP1c、115-kDa调节亚基肌球蛋白磷酸酶靶向亚基（MYPT1）以及功能未知的小21-kDa亚基。MYPT1包含多个磷酸化位点，其中Thr696（T696）和Thr853（T853）在磷酸化后会抑制MLCP活性。这种抑制增加了收缩机制的Ca²⁺敏感性。Rho/Rho激酶（Rho/ROCK）途径是这些位点磷酸化的主要调节者。在平滑肌中，即使在静息状态下也可观察到显著的磷酸化。T696在静息状态下始终高度磷酸化，表明有其他激酶如拉链相互作用蛋白激酶（ZIPK）和整合素连接激酶（ILK）参与。相比之下，T853的磷酸化通常响应收缩激动剂而增加。
   3.1.1 MYPT1磷酸化范式和血管张力调节
   体外生化分析表明，ROCK介导的MYPT1肽片段在这些苏氨酸位点的磷酸化使MLCP活性降低约25%。大多数研究报告T853磷酸化与血管力量的动态变化相关。然而，针对MYPT1-T853突变小鼠的研究未发现气管或膀胱收缩性发生变化，表明T853突变实际上无效，对血管收缩性影响可忽略不计。相反，T853是监测ROCK酶活性的极好标志物。T696磷酸化在体外直接抑制MLCP催化活性，而T853效果较差。T696A突变纯合子是围产期致死的，并降低胎儿回肠平滑肌中ROCK介导的松弛。这些发现确定T696磷酸化是MLCP和平滑肌张力的核心调节因子。此外，MLCP还能去磷酸化肌球蛋白II以外的众多细胞内底物，例如通过降低T696磷酸化来抑制黑色素瘤细胞增殖、调节突触小泡释放以及维持内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在T497的磷酸化。
   最近证明蛋白激酶G（PKG）特异性磷酸化MYPT1的Ser668（S668），该位点磷酸化会降低MLCP活性。这一机制被认为有助于NO信号下游的PK（应为PKG）介导的血管舒张。NO/cGMP/PKG级联反应通过两个不同阶段介导血管舒张：早期阶段通过PKC激活的磷酸酶抑制剂蛋白（CPI-17）去磷酸化实现Ca²⁺脱敏；以及持续阶段通过MYPT1抑制位点T696/T853或S668去磷酸化实现Ca²⁺非依赖性MLCP脱抑制。此外，MYPT1还可被PKA或PKG在Ser695（S695）磷酸化，这并不直接影响MLCP活性，但阻止随后T696的磷酸化。然而，关于T696和S695磷酸化相互排斥的假设受到质疑，因为最近的突变研究未在突变动脉中发现基础或激动剂诱导的S695磷酸化受影响。
   有趣的是，MYPT1在某些条件下（包括缺氧）会积聚在细胞核中。遗传学研究强调了MYPT1的重要作用：其在小鼠、秀丽隐杆线虫或黑腹果蝇中的缺失会导致胚胎致死。由于MYPT1在T696/T853的磷酸化在有丝分裂期间与MLCK、ROCK和citron激酶共定位在卵裂沟中，MLCP活性的改变预计会通过损害MLC₂₀磷酸化和肌动-肌球蛋白相互作用来影响胞质分裂。

3.2 PP1cδ催化活性通过结合伴侣的调节：CPI-17

几种MLCP结合蛋白直接抑制PP1c。其中，17-kDa PKC激活的磷酸酶抑制剂蛋白CPI-17有效抑制PP1c催化活性。CPI-17的抑制作用归因于磷酸化T38周围带正电荷的残基，它们能够与MYPT1-PP1c复合物相互作用并抑制其活性。CPI-17磷酸化发生在PKC激活下游，调节激动剂诱导的平滑肌收缩的初始阶段。相反，ROCK激活介导的Ca²⁺增敏调节收缩的紧张期。体外研究表明，ROCK可以同时激活CPI-17和ROCK。此外，ZIPK和ILK也可以磷酸化CPI-17的T38位点。这些研究揭示CPI-17是一个重要的调节平台，直接控制MLCP活性，其磷酸化状态受多种上游蛋白激酶调节。

现已确定，PKC/CPI-17信号代表小阻力动脉中的主要Ca²⁺增敏途径，而ROCK依赖的MYPT1磷酸化在较大动脉和静脉中发挥更突出的作用。体内研究证明了CPI-17的生理重要性：过表达CPI-17会诱发中度高血压，并增强肠系膜动脉对α₁-肾上腺素能拟似物、血栓素A₂类似物和血清素（5-HT）的收缩反应。然而，在某些组织（如脑血管或衰老股动脉）中，血压变化或激动剂刺激均未显著影响CPI-17磷酸化，对其在这些血管床中张力调节的相关性提出了疑问。

3.3 KRP/telokin和Ca²⁺脱敏

在某些组织中，Ca²⁺脱敏涉及一种平滑肌特异性肽，激酶相关蛋白（KRP）或telokin。KRP/telokin是一种17-kDa酸性蛋白，由编码平滑肌MLCK的同一基因转录。生化研究提出，KRP/telokin通过PKG信号传导介导Ca²⁺脱敏，据报道，它以组织特异性方式占cGMP依赖性Ca²⁺脱敏的约50%。KRP/telokin参与NO介导的舒张以及更广泛的肾上腺素能反应和环核苷酸依赖性舒张。从机制上讲，KRP/telokin干扰MLC₂₀磷酸化水平，但其确切分子细节仍不清楚。重要的是，KRP/telokin不直接影PP1δ催化活性，而是似乎促进磷酸化肌球蛋白与内源性MLCP的结合。体外研究表明，肌球蛋白结合对于KRP/telokin的抑制作用至关重要。现有证据表明KRP/telokin发挥双重作用：要么抑制力量产生，要么加速舒张，尽管这些机制仍未完全明确。KRP/telokin的磷酸化本身似乎也设定了基础MLCP活性。此外，其表达模式与MYPT1的亮氨酸拉链阳性（LZ⁺）亚型呈负相关，后者对NO/cGMP/PKG通路介导的血管舒张也至关重要。

1. 4.
   肌球蛋白磷酸酶靶向亚基（MYPT1）可变剪接变体的不同表达模式与平滑肌细胞对cGMP/PKG的差异敏感性相关
   cGMP/PKG诱导的Ca²⁺脱敏机制进一步归因于MYPT1 C末端亮氨酸拉链（LZ）基序的表达，该基序以组织和发育特异性方式表达。选择性mRNA剪接产生八种不同的MYPT1亚型，其差异在于中央插入的存在与否以及是否编码LZ阳性C末端。LZ基序对于PKG介导的MLCP激活至关重要。
   动脉表型的多样性似乎是基因编码的，甚至在发育早期就导致关键收缩和调节蛋白（包括MLCP）剪接变体的差异表达。在MYPT1的情况下，这种多样性源于外显子24（Ex24）的转录后剪接，这是组织特异性的且在哺乳动物和鸟类之间高度保守。早期发育阶段，平滑肌主要表达跳过外显子24的MYPT1亚型，包含LZ基序（LZ⁺）。然而，在成年生物体中，该程序仅在一部分血管组织（如主动脉、肺血管、大静脉）中保留。在大多数血管和内脏平滑肌中，发育重编程导致表达包含外显子24但缺乏LZ基序的MYPT1亚型（LZ^-）。缺乏LZ基序使MYPT1成为PKG的不良底物，降低了其激活MLCP的能力。与典型平滑肌不同，小阻力动脉似乎表现出中间表型，表达两种亚型但以包含外显子24的LZ^-变体为主。重要的是，LZ^-亚型的主导地位并非固定不变，因为在病理条件下可发生LZ⁺的可逆再表达，例如在门静脉高压、冠状动脉疾病、充血性心力衰竭和内毒素暴露模型中已证实LZ⁺/LZ^-比率的显著转变。此外，流动调节也与恶性和过度灌注下肠系膜动脉中LZ⁺的再表达有关。卡托普利在充血性心力衰竭中的保护作用与抑制LZ⁺再表达有关。此外，LZ⁺的再表达伴随着小鼠股动脉的衰老，表明这一现象可能有助于高龄时的血压调节。迄今为止，尚未建立明确的分子标志物来区分MYPT1亚型表达的生理发育重塑与病理重编程。
   与外周动脉相比，脑血管表现出中间表型，其特征是与外周动脉相比具有更高水平的外显子24包含转录物，产生MYPT1 LZ⁺。这与其对cGMP介导的舒张的敏感性增加相关。此外，在未受刺激的脑动脉中检测到基础磷酸化水平较高（S695和S668，PKA/PKG位点），这一特征类似于新生儿全身血管。因此，脑血管似乎逃避了大多数全身动脉所见的对MYPT1亚型表达的成熟转变。虽然MYPT1亚型表达模式与cGMP敏感性之间的相关性最初可能看似相关，但因果关系已在条件性外显子24敲除小鼠中得到证实，这些小鼠专门表达LZ+亚型。这些小鼠表现出增强的DEA-NONOate敏感性、迟钝的去甲肾上腺素反应和显著降低的血压。此外，PKG-1α中LZ基序的缺失与cGMP介导的舒张受损一致，支持这样的概念：MYPT1的C末端LZ与PKG-1α的N末端LZ之间的异源二聚化对于PKG介导的MLC₂₀去磷酸化、血管舒张和S668磷酸化至关重要。有趣的是，S668的基础磷酸化在脑动脉中比在外周动脉中高约2倍。这表明LZ⁺亚型表达和S668磷酸化的组合是脑血管中cGMP诱导的MLCP激活和血管舒张的重要决定因素。这一概念得到了透化动脉和HEK293T细胞实验的支持，其中cGMP诱导的MLCP激活因MYPT1-S668A片段或LZ^-亚型的表达而减弱。相比之下，外周血管中cGMP敏感性相对较低，cAMP诱导的舒张在脑血管和外周血管中同样有效，这表明cAMP介导的血管舒张较少依赖于MYPT1亚型组成，代表了平滑肌舒张的更普遍机制。

4.1 MYPT1及其对血管病理的调节影响

作为一个复杂多面的调节平台，血管MLCP特别是其亚基MYPT1可在多种病理条件下发生改变，包括氧化应激、心血管、肾脏、胃肠道或认知病理。

4.1.1 氧化应激中的MLCP功能和MYPT1药理学靶向作为一个治疗概念

在冠状动脉疾病患者中，血清氧化应激标志物与升高的RhoA和ROCK-1水平相关，表明存在活性氧（ROS）驱动的RhoA/ROCK信号通路激活。实验研究支持这一机制，显示ROS激活RhoA/ROCK通路，从而通过磷酸化其调节亚基MYPT1抑制MLCP，进而增加MLC磷酸化、平滑肌收缩、内皮僵硬和屏障功能障碍。ROCK和氧化应激之间的正反馈回路也被确定。升高的ROCK活性通过刺激NADPH氧化酶促进ROS生成。此外，过氧化氢通过ROCK依赖的NO-cGMP-PKG-MLCP信号通路抑制损害MLCP功能。ROCK还抑制PI3K/Akt通路，该通路通常激活内皮NO合酶（eNOS）并促进NO产生。过量的ROS还通过氧化可溶性鸟苷酸环化酶（GC）血红素铁从Fe²⁺到Fe³⁺，破坏可溶性GC-cGMP-PKG信号传导。总之，氧化应激相关机制通过减少PKG依赖的MLCP磷酸化来增强动脉平滑肌张力，导致血管功能障碍。除了抑制NADPH氧化酶介导的ROS生成，靶向ROCK和MLCP/MYPT1等下游效应器代表了保护血管的新策略。在老年杂合小鼠模型中，将MYPT1-Thr696替换为不可磷酸化的丙氨酸（MYPT1-T696A/+），脑血管对病理性高反应性具有内在保护。因此，未来研究应聚焦于通过遗传策略调节MLCP活性来实现血管舒张，而不是直接药理学抑制ROCK，以降低常见副作用风险。

4.1.2 循环系统中cAMP/PKA/MLCP依赖性张力调节剂

环核苷酸在调节血管张力中的重要性也引发了临床兴趣，旨在通过增强这些途径来治疗系统性高血压和心力衰竭。除了cGMP疗法，新的一类内源性肽分子如尿皮质素-1（UCN-1）引起了关注。UCN-1是促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）家族的成员，与人和鱼类肽具有高结构同源性。UCN-1是所有CRF受体亚型的内源性配体，与外周CRF-2受体结合的效力比神经元CRF-1受体高40倍。UCN-1或CRF诱导的血管舒张已在多种离体血管标本中被观察到。CRH受体激活与细胞内cAMP升高有关，导致PKA激活和血管舒张。CRF-2受体介导反应的功能意义已在缺乏该受体的小鼠中得到证实。研究还表明，CRH受体激活归因于通过降低MYPT1-T696/853的抑制性磷酸化来增加MLCP活性。所有这些数据支持这样的观点：UCN-1似乎是作为内源性cAMP/PKA依赖性血压和血流调节因子，其机制也涉及MLCP活性的调节。

4.1.3 MYPT1磷酸化和肾功能

MLCP靶向亚基MYPT1是肾小球前血管系统小动脉内广泛表达的分子。最近证明，肾血管系统中的交感神经力量激活伴随MLC₂₀磷酸化升高，部分由MLCP在MYPT1-T853的抑制性磷酸化增加介导。MYPT1亚基也是PKG介导的激活MLCP磷酸化（Ser668）的靶点。ROCK抑制剂Y27632降低MYPT1-T853和MLC₂₀的磷酸化，指出ROCK在调节MYPT1-T853抑制性磷酸化中的作用。ROCK抑制剂法舒地尔治疗恢复内皮反应性并减少链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾内动脉中MYPT1-853的病理性增加。在系膜细胞中，法舒地尔的药理学抑制改善了糖尿病对α-平滑肌肌动蛋白表达和MYPT1-T853磷酸化的有害影响。这些结果强烈表明，MLCP特别是MYPT1磷酸化程度对肾小球滤过至关重要。

4.1.4 缺氧条件下肺血管中的RhoA/ROCK/MLCP活性

缺氧在肺和全身循环中引起截然不同的反应。在全身血管床中，氧张力降低促进血管舒张，而在肺循环中，肺泡缺氧引起血管收缩（缺氧性肺血管收缩，HPV），重新分配血流远离通气不良的肺区。这种极性使得肺血管独特，因为缺氧作为生理性血管收缩刺激。在肺动脉中，缺氧触发膜去极化、Ca²⁺进入，并关键地增强收缩装置的Ca²⁺增敏。因此，除了细胞质Ca²⁺浓度的变化，缺氧差异调节肌球蛋白轻链激酶依赖性磷酸化和肌球蛋白轻链磷酸酶活性之间的平衡。线粒体是肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的主要氧传感器。缺氧改变了呼吸链内的电子流，导致ROS改变。在PASMCs中，这些氧化还原变化促进Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEFs）的激活，从而增加RhoA-GTP形成。重要的是，肺动脉似乎对ROS介导的RhoA激活异常敏感。缺氧优先增加肺循环中内皮素1（ET1）的产生，ET1通过G_12/13偶联受体信号传导是RhoA的有效激活剂。肺动脉表达氧敏感电压门控K⁺通道，其在缺氧期间的抑制产生膜去极化和Ca²⁺内流。肺动脉表现出较高的基础ROCK活性和更大程度依赖Ca²⁺增敏来调节张力。在慢性缺氧下，持续的RhoA激活有助于肺血管重塑和持续性血管收缩。

4.1.5 MLCP作为血压的调节因子

MLCP使MLC₂₀去磷酸化从而降低肌动-肌球蛋白复合物的ATP酶活性，这一事实促使研究人员探索该酶活性如何调节血压。全面研究表明，平滑肌组织特异性MYPT1敲除引起收缩压、舒张压和平均动脉压的稳定增加，其效应归因于外周动脉收缩反应的增加。靶向直接MLCP抑制剂CPI-17的T38磷酸化诱导小而稳健的血压下降。同时，其他研究人员证明过表达MYPT1 LZ⁺剪接变体可降低血压和外周阻力。条件性敲除外显子24并因此主要表达MYPT1 LZ⁺会增加NO敏感性并抑制高盐饮食的过度收缩血管反应。总之，这些发现表明MLCP活性特别是MYPT1特异性剪接变体亚型表达在血压维持中起关键作用。

4.2 展望

新出现的证据将MLCP及其调节亚基MYPT1定位为血管张力信号传导的关键分子调节因子，具有巨大的治疗潜力。MYPT1剪接变体的表达，特别是LZ⁺亚型，决定了对cGMP/PKG介导的舒张的敏感性，这表明靶向可变剪接可能改善全身和脑血管的血管功能障碍。涉及能够穿过血脑屏障的试剂的药理学策略，可能优先增强脑血管舒张，同时最小化全身性低血压。互补的方法，包括通过NADPH氧化酶抑制或MLCP等下游效应器进行ROS调节，提供了减轻年龄或疾病相关高收缩性的额外途径。总之，这些见解支持开发针对MLCP调节、氧化应激和信号通路的综合治疗策略，以在衰老和病理条件下保护脑血管功能。