《Cellular Signalling》：Hederacolchiside A1 targets ERO1A to suppress PI3K/AKT/mTOR signaling and induce ferroptosis in colorectal cancer
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摘要结直肠癌因其高发病率、不良预后以及有限的治疗手段，依然是全球重大的健康问题。铁死亡是一种依赖铁离子的程序性细胞死亡形式，被视为具有潜力的抗肿瘤策略，但目前用于诱导铁死亡的药物仍缺乏研究。本研究探讨了天然生物活性化合物海芋碱A1的抗癌作用及其机制。在体外实验中，海芋碱A1能以剂
摘要
结直肠癌因其高发病率、不良预后以及有限的治疗手段，依然是全球重大的健康问题。铁死亡是一种依赖铁离子的程序性细胞死亡形式，被视为具有潜力的抗肿瘤策略，但目前用于诱导铁死亡的药物仍缺乏研究。本研究探讨了天然生物活性化合物海芋碱A1的抗癌作用及其机制。在体外实验中，海芋碱A1能以剂量依赖的方式抑制HT-29、SW-480、HCT-116和MC-38细胞的增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡，并调节上皮-间质转化相关标志物，升高E-钙粘蛋白水平，同时降低波形蛋白、Slug蛋白以及MMP2和MMP9的表达。铁死亡的诱导表现为活性氧、脂质过氧化以及细胞内Fe2+浓度上升，而还原型谷胱甘肽水平下降，氧化型谷胱甘肽水平上升。海芋碱A1通过直接作用于内质网氧化还原酶1α，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，进而下调铁死亡防御蛋白SLC7A11和GPX4的表达。在HT-29移植瘤模型中，海芋碱A1显著降低了肿瘤体积和重量，减少了Ki67和CD31蛋白的表达，增加了TUNEL阳性细胞数量，且全身毒性较低。免疫荧光和西方印迹分析进一步证实了其在体内对PI3K/AKT/mTOR通路成分及铁死亡相关蛋白的抑制作用。总体而言，这些研究结果表明海芋碱A1可通过直接靶向ERO1A，抑制PI3K/AKT/mTOR-SLC7A11/GPX4轴，从而诱导铁死亡，发挥强大的抗结直肠癌作用。本研究为将海芋碱A1作为潜在的结直肠癌治疗药物提供了机制依据。
引言
结直肠癌是全球范围内最为常见且致命的消化道恶性肿瘤之一[1]、[2]。流行病学数据表明，结直肠癌的全球发病率持续上升，晚期患者的五年生存率仍低于50%[3]、[4]。尽管在外科切除、化疗方案以及靶向治疗方面取得了显著进展，但由于固有和获得性药物耐药性、高复发率以及严重的全身毒性，临床治疗效果仍然受限[5]、[6]、[7]。因此，开发具有明确作用机制的新型抗肿瘤药物已成为结直肠癌研究中的当务之急。
铁死亡是一种新近被发现的程序性细胞死亡形式，它独特地依赖于铁离子，其发生与活性氧积累及脂质过氧化密切相关[8]、[9]。从机制上来看，铁死亡与细胞凋亡、坏死和自噬有所不同，且越来越被认为具有强大的抗肿瘤潜力[10]。通过扰乱氧化还原平衡并增强脂质过氧化，铁死亡能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[11]、[12]。在结直肠癌中，重要的铁死亡调控因子包括SLC7A11、GPX4、FTH1和ACSL4，越来越多的证据表明PI3K/AKT/mTOR信号通路可以调控这些因子的表达和活性，从而间接影响细胞对铁死亡的敏感性[13]、[14]。然而，针对结直肠癌中铁死亡机制的药物策略仍缺乏研究，尤其是关于天然化合物诱导铁死亡的机制，这一问题亟需进一步探索。
天然产物长期以来被视为富含结构多样且具有生物活性的分子库，这类分子往往具有良好的抗癌效果和较低的毒性[15]、[16]。从天然植物中分离得到的海芋碱A1在初步研究中已显示出细胞毒性和抗肿瘤潜力[17]、[18]、[19]。不过，其在结直肠癌中发挥抗癌作用的具体分子机制尚未完全明确，尤其是在其触发铁死亡以及调控关键信号通路方面的作用机制。
内质网氧化还原酶1α是一种存在于内质网中的氧化酶，它在蛋白质折叠以及维持细胞氧化还原平衡方面起着关键作用[20]。在多种恶性肿瘤中，ERO1A的表达常常升高，它可以通过激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，同时参与氧化应激调控和铁离子平衡维持[21]。这些特性使得ERO1A成为连接信号通路与铁死亡发生的潜在上游调控因子，也为海芋碱A1等天然化合物的靶向作用提供了理论基础。多项证据进一步支持海芋碱A1可能直接靶向ERO1A的观点。首先，ERO1A在多种恶性肿瘤中表达升高，可通过激活PI3K/AKT通路促进肿瘤细胞增殖[21]；其次，有研究表明天然化合物可直接与ERO1A结合，例如在胆管癌中，2′,4′-二羟基查尔酮可通过ERO1A/GPX4调控轴诱导铁死亡[22]；第三，作为天然皂苷类化合物，海芋碱A1与其他植物源的ERO1A靶向物质具有相似的结构特征，因此很可能是直接作用于ERO1A的候选物质。
基于以上分析，我们提出假设：海芋碱A1可能通过直接靶向ERO1A，诱导结直肠癌细胞发生铁死亡，进而抑制其增殖、迁移以及上皮-间质转化过程。这种相互作用有望抑制PI3K/AKT/mTOR信号轴，从而破坏SLC7A11/GPX4介导的抗氧化防御系统（见图1）。为验证这一假设，本研究系统地探讨了海芋碱A1在结直肠癌中的抗肿瘤作用及其分子机制，具体包括：（1）检测其在体外对细胞增殖、迁移以及凋亡/铁死亡的影响；（2）分析其对上皮-间质转化相关生物标志物以及PI3K/AKT/mTOR-SLC7A11/GPX4信号通路的调控作用；（3）研究海芋碱A1与ERO1A之间的结合机制及可能的作用途径；（4）在相关动物模型中评估其抗肿瘤效果及初步安全性。（详见表1。）
本研究的创新之处在于首次系统证明海芋碱A1可通过靶向ERO1A，调控PI3K/AKT/mTOR-SLC7A11/GPX4轴，从而诱导铁死亡，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和生长，发挥抗结直肠癌作用。这项研究不仅深化了人们对天然产物介导抗肿瘤机制的理解，还为海芋碱A1作为结直肠癌治疗药物的可行性提供了实验依据。
章节摘录
化学试剂与抗体
天然化合物海芋碱A1购自MedChemExpress（商品编号HY-N6950，MCE）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，商品编号12491015）、胎牛血清（FBS，商品编号10100147）以及青霉素-链霉素混合液（商品编号15070063）均购自Gibco公司。Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8，商品编号HY-K0301）则从MedChemExpress购买。细胞内活性氧的检测则采用DCFH-DA荧光探针以及Beyotime公司的DCFH-DA活性氧检测试剂盒（商品编号……）进行。
海芋碱A1可抑制结直肠癌细胞的增殖
我们首先评估了海芋碱A1对多种结直肠癌细胞系的细胞毒性作用。海芋碱A1的化学结构如图1A所示，可见其具有典型的天然生物活性结构框架。CCK-8检测结果显示，海芋碱A1能以剂量依赖的方式抑制HT-29、SW-480、HCT-116和MC-38细胞的存活能力。各细胞的IC??值计算如下：HT-29细胞的IC??值为1.978?μM（95%置信区间为1.942–2.014，R2=0.9928）；SW-480细胞的IC??值为3.956?μM（95%置信区间为3.884–4.028，R2……）
讨论
结直肠癌依然是全球重大的健康问题[31]、[32]，而铁死亡则被视为该疾病中具有治疗潜力的关键靶点[8]、[9]、[10]。虽然已有研究表明多种天然化合物能够诱导结直肠癌中的铁死亡，但大多数这类化合物要么直接作用于SLC7A11或GPX4等终末效应因子，要么仅起到产生活性氧的作用[13]、[14]。本研究则发现了一种机制上不同的策略：海芋碱A1可以直接靶向ERO1A，即上游……
结论
综上所述，本研究表明天然化合物海芋碱A1可通过直接靶向ERO1A，抑制PI3K/AKT/mTOR-SLC7A11/GPX4信号轴，从而诱导铁死亡，发挥强大的抗结直肠癌作用。在体外实验中，海芋碱A1能有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及上皮-间质转化；在体内实验中，则可减少肿瘤的生长、增殖以及血管生成，且初步安全性良好。这些……
作者贡献说明
李佩佩：负责原始稿件撰写、结果可视化、验证、方法设计、实验实施、正式数据分析以及数据整理工作。毕涛：负责实验实施及正式数据分析。刘一帆：负责实验实施及数据整理。曹丹：负责实验实施及正式数据分析。刘迪：负责实验实施及数据整理。董甜甜：负责实验实施及数据整理。习作武：负责稿件审阅与编辑、项目监督、项目管理、资金申请以及研究构思工作。
发表同意书
本研究的所有参与者均已签署书面知情同意书，同意将其个人数据用于论文发表。
伦理审批与参与同意
本研究严格遵循河南中医药大学实验动物伦理委员会的规范要求开展，相关实验方案已获得该校实验动物伦理委员会的批准（批准编号为HNSZYYYJS202301151）。
资金支持
本研究得到了河南省中医药领军人才计划的资助（项目编号为YWZYH[2021]8）。
李佩佩|曹 Linguo|毕涛|刘一帆|曹丹|刘迪|董甜甜|习作武
中国河南省郑州市河南中医药大学第二临床医学院，邮编450053
