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融合转录本最初在癌症中被表征，随着二代测序（NGS）的发展，在植物中的报道日益增多。然而，其普遍性和生物学相关性仍存在高度争议，特别是在检测相关的技术挑战下。在此，研究人员整合了来自水稻的多个高质量长读长RNA测序数据集，对植物中的融合转录本检测进行了系统评估
融合转录本最初在癌症中被表征，随着二代测序（NGS）的发展，在植物中的报道日益增多。然而，其普遍性和生物学相关性仍存在高度争议，特别是在检测相关的技术挑战下。在此，研究人员整合了来自水稻的多个高质量长读长RNA测序数据集，对植物中的融合转录本检测进行了系统评估，证明几乎所有检测到的融合转录本均源于技术和分析伪影，而非真实的生物学事件。在机制上，研究人员确定了反转录过程中短同源序列（SHS）介导的模板转换是虚假融合的主要来源，尤其是在基于PCR的流程中。其他促成因素包括比对错误、参考基因组偏差和基因错误注释。研究人员进一步揭示了反复出现的伪影热点，这解释了融合信号的非随机分布。通过重新设计的体外和体内验证实验，研究人员证明常检测到的融合信号缺乏可重复性，且并不反映真实的转录组事件。至关重要的是，研究人员建立了一个金标准验证流程，优先考虑长读长直接RNA数据、参考序列感知比对和严格的实验验证，以确立识别真实融合转录本的新的可重复性标准。结论：研究在多个测序平台上针对植物进行了全面的、以植物为中心的融合转录本伪影实验剖析。这些发现挑战了关于植物中融合转录本丰度的普遍假设，并为可靠识别这些转录本建立了稳健的框架，对复杂基因组的转录组学研究具有广泛意义。
融合转录本包含来自两个不同基因的序列，其形成途径可分为DNA水平融合与RNA水平融合。随着二代测序技术的发展，植物中大量融合转录本被报道，但研究人员观察到几个令人困惑的趋势：不同物种间报道的融合载数量差异巨大；许多融合涉及相邻基因，更可能归因于基因模型错误注释；验证策略多依赖PCR技术而缺乏关键对照；且多数研究未区分DNA和RNA水平的融合。为了评估植物中融合转录本的真实性与复杂性，研究人员开展了此项研究。该研究整合了多个长读长RNA测序平台的数据，对融合转录本进行了全面分类、定量及机制剖析，揭示了虚假融合的隐蔽复杂性，证明了植物中可靠的融合转录本极为罕见，并建立了一个稳健的鉴定框架。该论文发表在《Genome Biology》。
在关键技术方法方面，研究人员主要利用了三种长读长RNA测序平台：PacBio IsoSeq、Nanopore 直接RNA测序和Nanopore PCR扩增cDNA测序，以及短读长RNA测序技术。样本队列来源为水稻品种明恢63（MH63）和珍汕97（ZS97）及其杂交种汕优63（SY63）的特定组织样本。研究辅以基于流式细胞荧光分选（FACS）技术的体内水稻原生质体验证系统和体外PCR验证体系，结合JAFFAL等生物信息学分析流程，对融合转录本进行了全面鉴定、分类与溯源。
研究结果如下：
各测序平台中虚假融合转录本的普遍性
研究人员通过对来自水稻品种MH63的三种长读长测序数据集进行评估，鉴定出不同数量的融合转录本。令人惊讶的是，在dRNAseq和cDNAseq数据集之间仅有极少数高置信度（HC）融合被一致检测到，且在生物学重复中的重叠率极低。分析表明，尽管大量融合源自不同染色体并表现出高表达，但与三维基因组空间互作数据集的重叠极小，这表明核内三维空间邻近性并非融合形成的主导机制。在其他物种和组织中的扩展分析进一步证实，大多数融合缺乏一致的支持，可能代表技术噪音。
短同源序列介导的模板转换是假阳性融合转录本的主要来源
研究将融合断裂点分为SHS、Joined、Unknown和Misaligned四类。分析显示，基于PCR的方法中，SHS介导的事件占所有融合的75.43%。通过体外验证实验，研究人员证明SHS是产生特定融合信号所必需的，且使用不同反转录酶显示这些信号源于反转录过程中的模板转换而非真实的生物学事件。通过水稻原生质体体内实验进一步验证，发现在仅转染外源转录本而不可能发生真实融合的情况下，依然能检测到SHS介导的融合信号，明确证明了此类融合信号是与检测过程固有相关的技术伪影。
非SHS介导的假阳性融合转录本的复杂起源
对其他三类断裂点的深入分析揭示了更为复杂的机制。Unknown型融合可能源于RNA样本制备过程中核酸抗性基因组成转录组片段的连接。Joined型融合中，55%在重新分析时被发现隐含SHS，其余则被确认为比对错误、潜在结构变异（SVs）、短比对伪影或与Helitron转座子相关的融合，表明某些被误认为反式剪接的融合实际上是源于DNA水平的变异。Misaligned型融合则表现出比对质量低且含有更相似基因的特征，校正碱基识别错误可大幅减少此类假阳性。网络分析显示，基因网络呈高度非随机拓扑结构，少数高连接度“枢纽”基因参与了大量融合事件，可作为标记技术伪影的可靠指标。
融合检测对注释质量和参考基因组选择的敏感性
为了探究错误注释的相邻基因是否模拟了融合转录本，研究人员分析了短读长RNA测序数据。结果表明，74%的相邻基因融合实际上是因注释错误而被错误拆分的单一转录本。研究还发现，融合检测高度依赖于所选参考基因组。研究者将原本比对到MH63参考基因组的ZS97数据重新比对回ZS99参考基因组，发现88.47%的融合读长是因基因型间结构变异而产生的假阳性。
杂交种中缺乏可靠的等位与非等位融合
研究人员利用MH63、ZS97及其杂交种SY63的杂交系统，通过跨配对读长分析系统性鉴定等位与非等位融合。结果发现，在组织和数据集之间重叠极少，表明大多数候选者为不可重现的假阳性。通过与亲本RNA混合物对照的强相关性，鉴定出大量由模板转换产生的伪影。人工审查未能验证任何可靠的融合事件，而等位融合也表现出与高表达和长基因相关的假阳性特征。实验验证最终证实了这些候选者的技术伪影起源。
在讨论部分，研究人员指出，植物中真正可靠的融合转录本，尤其是由反式剪接产生的，极为罕见。大多数观察到的案例是由SHS介导的融合伪影，其他假阳性则源于比对错误、注释质量和参考序列选择等因素。因此，研究人员提出，在鉴定真实植物融合转录本时应优先考虑长读长直接RNA测序以避免PCR扩增伪影；使用基因型匹配的参考基因组和高质量注释以减少比对误差；并在PCR实验中纳入严格的对照。总结而言，在没有严格质量控制的情况下，植物融合转录本的生物学意义仍不确定。该研究提供了一个系统验证框架，不仅解决了测序技术带来的新挑战，也为未来在植物转录组中严谨探索真实的融合事件奠定了基础。
