禾本科植物通过GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s模块实现除草剂代谢抗性的机制研究

《Advanced Science》：Herbicide Metabolic Resistance in Poaceae Plants via the GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s Module

　　

稗草(Echinochloa crus-galli)是全球最重要的杂草之一，该物种除草剂抗性的进化威胁着水稻和玉米生产。细胞色素P450(cytochrome P450，P450)介导的除草剂代谢解毒是一种普遍的抗性机制，但其上游调控机制尚不清楚。本研究揭示了一个连接赤霉素(gibberellin，GA)信号与除草剂解毒的重要调控模块。研究人员在稗草中鉴定到DOF家族转录因子(transcription factor，TF)DOF2作为重要调控因子，直接激活除草剂解毒基因，包括稗草中的CYP81A21和CYP704A371，以及水稻中的CYP81A6。DOF2在抗性稗草中组成型升高，并进一步被除草剂处理诱导。在稗草中过表达DOF2或其水稻直系同源基因赋予抗性，而敲除水稻直系同源基因则增加敏感性。机制上，DELLA蛋白SLR1与DOF2相互作用抑制其转录活性，GA信号解除这种抑制。研究人员进一步表明除草剂处理迅速上调GA生物合成基因，导致GA水平升高从而触发该通路。重要的是，该GA–GID1/DELLA–DOF2–P450轴至少在两种禾本科(Poaceae)物种中运作，表明一种保守的调控逻辑。这些发现建立了植物激素信号与除草剂代谢抗性之间的直接机制联系，对杂草抗性管理和作物耐受性改良具有重要意义。

研究背景方面，杂草是全球可持续作物生产的重要限制因素，除草剂的广泛使用导致杂草进化出除草剂抗性，威胁粮食安全。除草剂抗性主要由靶标位点抗性(target-site resistance，TSR)和非靶标位点抗性(non-target-site resistance，NTSR)介导，其中NTSR中的代谢除草剂抗性因涉及P450等大型超家族基因，具体抗性基因识别困难，且上游转录调控机制不明，成为亟待解决的难题。稗草是水稻田恶性杂草，对乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)抑制剂类除草剂如penoxsulam的抗性日益严重，明确其代谢抗性调控机制对杂草治理和作物育种具有重要意义。研究人员以稗草和水稻为材料，揭示了GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s模块调控除草剂代谢抗性的机制，该论文发表在《Advanced Science》。

关键技术方法包括：从已发表的稗草抗感种群RNA-seq数据中筛选差异表达的转录因子(transcription factor，TF)和P450基因；建立农杆菌介导的同源转化系统获得转基因稗草过表达EcDOF2株系，以及水稻过表达EcDOF2、OsDOF2、下游P450基因和利用CRISPR/Cas9敲除OsDOF2、OsGID1、OsSLR1的突变体；采用DNA亲和纯化测序(DNA affinity purification sequencing，DAP-seq)鉴定EcDOF2全基因组结合位点；通过RNA-seq分析EcDOF2过表达稗草和水稻OsDOF2敲除突变体的差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)；利用酵母单杂交(yeast one-hybrid，Y1H)、双荧光素酶报告系统、电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)验证DOF2与P450启动子结合及转录激活；通过酵母双杂交(yeast two-hybrid，Y2H)、荧光素酶互补成像(luciferase complementation imaging，LCI)、GST pull-down、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)验证DELLA与DOF2蛋白互作；测定内源活性GA₁、GA₃、GA₄、GA₇含量及施用GA₃和GA合成抑制剂paclobutrazol(PAC)进行功能验证；样本来源于稗草抗性(resistant，R)和敏感(susceptible，S)种群及水稻品种ZH11。

研究结果如下：

2.1 EcDOF2作为与稗草除草剂抗性相关的核转录激活因子。研究人员通过对抗感种群RNA-seq再分析筛选出EcDOF2在抗性种群中组成型高表达且被penoxsulam诱导上调，克隆测序未发现编码区非同义突变及启动子差异。亚细胞定位显示EcDOF2定位于细胞核，转录激活实验表明其C端具有转录激活能力，确认为核转录因子。

2.2 在稗草和水稻中表达EcDOF2及水稻直系同源基因OsDOF2赋予penoxsulam抗性/耐受性。研究人员在敏感稗草中过表达EcDOF2显著提高存活率、株高和生物量；在水培和整株水平，过表达EcDOF2或OsDOF2的水稻对penoxsulam耐受性增强；CRISPR/Cas9敲除水稻OsDOF2导致突变体对penoxsulam敏感性增加，证实DOF2正向调控禾本科植物除草剂抗性/耐受性且功能保守。

2.3 利用DAP-seq全基因组鉴定EcDOF2结合位点。研究人员通过DAP-seq在稗草基因组中鉴定到63036个高置信度EcDOF2结合峰，主要分布于远端基因间区和转录起始位点(transcription start site，TSS)上游，富集保守(A/T)AAAG核心基序，锁定17311个潜在靶基因含53个P450基因。

2.4 通过RNA-seq鉴定稗草和水稻中DOF2调控的基因。研究人员对EcDOF2过表达稗草和水稻OsDOF2敲除突变体进行RNA-seq，发现DOF2主要作为转录激活因子调控应激响应和外源物质代谢相关基因，多个P450基因如EcCYP81A21在过表达株系显著上调，水稻中OsCYP81A6在敲除株系显著下调。

2.5 确定稗草和水稻中DOF2调控的潜在靶标P450基因。研究人员整合DAP-seq与RNA-seq数据获得446个EcDOF2直接靶基因，GO和KEGG富集于解毒与应激适应通路，明确EcCYP81A21和EcCYP704A371为EcDOF2直接上调的P450基因，水稻中OsCYP81A6为OsDOF2直接靶标。

2.6 DOF2直接结合稗草和水稻P450s启动子进行转录激活。研究人员通过Y1H、双荧光素酶、EMSA在体内外证实EcDOF2特异性结合EcCYP81A21和EcCYP704A371启动子的DOF结合基序并激活转录；OsDOF2直接结合OsCYP81A6启动子激活转录，但不直接结合OsCYP704C1，确立保守的DOF2–P450调控轴。

2.7 DOF2下游P450s的表达赋予稗草和水稻除草剂抗性/耐受性。研究人员在水稻中过表达EcCYP81A21和EcCYP704A371均增强penoxsulam耐受性；EcDOF2过表达稗草对pinoxaden和bensulfuron-methyl也表现抗性；水稻过表达OsCYP81A6提高penoxsulam耐受性，证实DOF2下游P450是代谢解毒的功能效应因子。

2.8 GA信号可能是稗草中EcDOF2介导penoxsulam抗性的上游调控因子。研究人员发现抗性稗草GA合成基因EcGA20ox、EcGA3ox表达及活性GA₁、GA₃、GA₄、GA₇水平显著高于敏感种群。外源GA₃迅速诱导EcDOF2及其下游P450表达；GA合成抑制剂PAC处理降低抗性稗草存活率并抑制DOF2和P450表达；水稻osdof2突变体中GA₃无法恢复penoxsulam耐受性，表明GA通过DOF2正向调控解毒基因。

2.9 GID1在DOF2依赖的除草剂抗性中起正向作用。研究人员发现抗性稗草EcGID1高表达；水稻OsGID1敲除突变体表现GA缺陷矮化表型，对penoxsulam敏感性显著增加，OsDOF2和OsCYP81A6表达下调；外源GA₃无法挽救OsGID1突变体敏感性，表明GA-GID1-DOF2-CYP81A6级联事件存在，该模块在稗草中同样运作。

2.10 DELLA在DOF2依赖的除草剂抗性中起负向作用。研究人员通过Y2H、LCI、GST pull-down、Co-IP证实稗草EcDELLA与EcDOF2、水稻OsDELLA与OsDOF2在体内外物理互作，竞争性EMSA显示DELLA以剂量依赖方式抑制DOF2与P450启动子结合。过表达EcDELLA或OsDELLA的水稻对penoxsulam敏感性增加；水稻osslr1敲除突变体（DELLA降解）对penoxsulam耐受性增强；GA₃在osslr1突变体中无法进一步增强耐受性，表明低GA下DELLA抑制DOF2活性，GA感知后DELLA降解解除抑制激活P450表达。

讨论部分总结：研究人员指出NTSR代谢抗性涉及超大代谢酶家族且调控网络复杂，TF在除草剂抗性中的上游调控长期不明。本研究阐明EcDOF2通过直接激活稗草CYP81A21、CYP704A371和水稻CYP81A6赋予抗性，填补了激素信号与代谢解毒间的机制空白。DOF2调控的CYP81A亚家族及CYP704A371均在禾本科除草剂代谢中具有功能，TF可能作为多P450共同调控者使抗性呈单基因遗传假象，为抗性基因挖掘提供新视角。EcDOF2在抗感种群中编码序列及启动子无差异，抗性源于上游表达调控而非序列突变。GA-GID1/DELLA-DOF2-P450模块将发育激素途径与代谢防御偶联，抗性种群内源GA升高驱动DOF2组成型上调，除草剂诱导ROS可能通过MAPK上调GA合成进而激活该通路（后者未在本研究实验验证）。研究人员首次建立转基因稗草体系验证了DOF2功能，克服了模式植物异源验证的局限。DOF2可作为抗性诊断标记及基因编辑或化学抑制的靶点，如稳定DELLA或阻断DOF2结合可逆转抗性，同时需注意GA途径调节剂可能加速抗性演化。该模块在测试禾本科物种中保守，但是否存在于双子叶及其他植物需后续研究，内源激素状态可预调节除草剂响应，生理可塑性参与抗性进化。

研究结论翻译：总之，研究发现揭示了一个此前未被认识的调控模块，其中GA信号激活DOF2以驱动除草剂解毒P450基因的表达。该模块将发育激素途径与代谢防御联系起来，为生长旺盛与除草剂抗性/耐受性植物之间提供了机制基础。通过证明DOF2作为GA-GID1/DELLA级联下游的直接转录激活因子，建立了一个连接激素驱动的生长调控与诱导性外源代谢的概念框架。该GA-GID1/DELLA-DOF2-P450s轴作为一种适应性调控策略在测试的禾本科物种（稗草和水稻）中得到实验验证，能够在除草剂选择下快速重编程解毒能力。这一调控级联是否在双子叶植物和其他不同植物类群中保守尚未确认，需在今后工作中进一步研究。重要的是，工作揭示内源激素状态可以预处理除草剂响应性，表明生理可塑性在抗性进化中发挥作用。

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