衰老过程中小鼠胸腺的单细胞和空间分辨转录组与免疫组库揭示免疫异质性和胸腺选择压力的方向

《Aging Cell》：Single Cell and Spatially Resolved Transcriptome and Immune Repertoire of Mouse Thymus During Aging Reveal Immunological Heterogeneity and Direction of Thymic Selection Pressure

　　

胸腺是T细胞分化和增殖的中枢器官。T细胞经历T细胞受体（TCR）重组以产生多样性、自身抗原耐受性和免疫应答。然而，衰老过程中胸腺转录组和免疫组库的空间异质性尚未被研究。研究人员通过TCR特异性扩增构建了胸腺的空间转录组和空间免疫组库图谱。研究人员开发了整合多组学分析，包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组测序（ST-seq）、空间TCR测序（spatial-TCR-seq）、单细胞TCR测序（scTCR-seq）和TCR测序（TCR-seq），以研究衰老过程中的胸腺。ST-seq揭示了皮质的异质性，并鉴定了一个与祖细胞分化相关的新型皮质亚群。在衰老过程中，增殖性CD69^negDN T细胞减少，而调节性CD4^SP T细胞增加。通过反卷积分析，揭示了T细胞亚群的空间分布。研究人员展示了TCR重组和不同胸腺选择过程的空间分布。伪时间分析揭示了T细胞的分化顺序和空间迁移路径。新型空间TCR-seq展示了TCR的整体空间分布、TCR配对过程及其在胸腺选择压力下的动态特征，揭示了具有亲水性和低等电点（pI）CDR3的TRB克隆型倾向于通过阴性选择，这与阳性选择相反。在衰老过程中，胸腺的阳性选择压力减弱。研究人员利用TCR-seq开发了一个TCR成熟评分系统，以识别倾向于成熟的TCR克隆型。所有这些研究将胸腺研究推进到空间免疫组库和转录组时代，并拓宽了研究人员对T细胞发育的认识。

**论文解读：衰老小鼠胸腺的单细胞及空间分辨转录组与免疫组库研究**

**研究背景与问题**

胸腺是T细胞分化和成熟的中枢器官，T细胞在胸腺中经历TCR重组产生多样性，并通过阳性选择和阴性选择获得自身抗原耐受性和MHC限制性。然而，衰老过程中胸腺的转录组和免疫组库的空间异质性尚未被系统研究。现有研究多基于bulk或单细胞水平，缺乏空间维度的解析，难以揭示T细胞发育与胸腺微环境之间的空间关联。此外，衰老导致的胸腺退化和免疫功能下降的分子机制仍不明确。因此，研究人员开展了这项研究，旨在构建衰老小鼠胸腺的高分辨率空间转录组和免疫组库图谱，阐明T细胞发育的空间动态及胸腺选择压力的变化。

**研究内容与结论**

研究人员利用scRNA-seq、ST-seq、spatial-TCR-seq、scTCR-seq和TCR-seq等多组学技术，系统分析了5周龄（年轻）和12月龄（中年）C57BL/6雌性小鼠胸腺的细胞异质性、空间结构和免疫组库特征。研究发现：衰老胸腺中CD69^negDN T细胞减少，调节性CD4^SP T细胞增加；TCR重组和阳性选择受抑制，而阴性选择和T细胞凋亡增强。通过ST-seq，鉴定出6个亚结构，其中Cortex_0是一个与祖细胞分化相关的新型皮质区域，验证发现其存在于人类胸腺中。伪时间分析揭示了T细胞从CMJ经皮质向被膜下区或髓质的迁移路径。空间TCR-seq首次展示了TCR克隆型的空间分布，发现TRB克隆型CDR3的理化性质（如亲水性和pI）在阳性选择和阴性选择中呈现相反趋势，亲水性和低pI的CDR3倾向于通过阴性选择。此外，衰老过程中阳性选择压力减弱。基于TCR-seq数据，研究人员构建了TCR成熟评分系统，可预测TCR克隆型的成熟潜力。该研究发表于《Aging Cell》。

**主要技术方法**

研究人员采用多平台整合策略：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq，Mozhuo平台）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）分析细胞组成和免疫组库；2）空间转录组测序（ST-seq，10× Genomics Visium平台及SeekSpace单细胞空间转录组技术）解析组织亚结构；3）针对cDNA文库进行TCR特异性扩增，开发新型空间TCR测序（spatial-TCR-seq）以获取空间免疫组库信息；4）对5个生物学重复的胸腺及配对PBMC进行bulk TCR-seq，用于构建TCR成熟评分模型。样本均来自武汉大学动物实验中心提供的C57BL/6小鼠。

**研究结果**

**2.1 单细胞转录组揭示小鼠胸腺衰老过程中的异质性**

通过scRNA-seq对胸腺细胞进行注释，发现衰老样本中NK细胞和B细胞比例显著升高，而肥大细胞和T细胞比例降低。衰老样本中富集T细胞凋亡、炎症反应和γδT细胞激活，而祖细胞分化、TCR重组和胸腺阳性选择受抑制，调节性CD4 T细胞分化和阴性选择更活跃。

**2.2 空间分辨转录组揭示小鼠胸腺衰老过程中的结构**

ST-seq将胸腺划分为6个亚结构（CMJ、三个皮质亚区、被膜下区和髓质）。其中Cortex_0为新型区域，高表达祖细胞迁移相关基因（Ccl25、Ccr9）和CD69^negDN标志物。衰老样本中CMJ和髓质比例下降，Cortex_0和被膜下区比例上升，且组织结构分散度增加。通过反卷积分析，B细胞、单核吞噬细胞和NK细胞富集于CMJ和髓质。

**2.3 胸腺T细胞谱系分化及其空间分布**

T细胞亚群分析显示，CD69^negDN_14簇（增殖性）在衰老中显著减少，CD4^SP_18簇（调节性）显著增加。CD69^negDN_14定位于Cortex_0，CD4^SP_18主要位于CMJ和髓质。CD69^posDP T细胞富集于Cortex_0，且CD69^negDN T细胞的早期亚群（CD44^hi）靠近CMJ，晚期亚群（Il2ra^hi）在Cortex_0。

**2.4 伪时间轨迹分析与转录因子鉴定**

scRNA-seq伪时间轨迹显示CD4^SP T细胞早于CD8^SP T细胞出现。ST-seq轨迹显示T细胞从CMJ经皮质向被膜下区（凋亡）或髓质（成熟）迁移。衰老样本中T细胞分化受阻。被膜下区特异富集转录因子Maz，其与T细胞凋亡和蛋白泛素化正相关。

**2.5 衰老过程中B细胞、NK细胞与CD69^negDP T细胞的MHC介导相互作用增强**

细胞通讯分析显示，衰老胸腺中NK细胞和B细胞分别通过MHC-I和MHC-II与CD69^negDP T细胞相互作用增强，且Fasl-Fas凋亡通路在NK细胞与CD69^negDP T细胞间增强。

**2.6 新型空间TCR-seq揭示TCR克隆型的空间分布**

spatial-TCR-seq成功获得TCR序列的空间位置。髓质区域TCR多样性、克隆性和丰富度均高于皮质。伪时间轨迹中，早期TCRβ CDR3呈亲水性和低pI，晚期进一步富集这些特征。

**2.7 通过scTCR-seq比较胸腺T细胞亚群间的TCR克隆型**

CD4^SP和CD8^SP T细胞富集特定TRB VJ基因模式，CDR3长度较短，且疏水性和pI在SP T细胞中显著降低。

**2.8 TCR配对与特定空间分布和转录特征相关**

pre-TCRα（Ptcra）转录本富集于皮质和被膜下区，TCRα在髓质中更多。Ptcra(+)区域与TCR重组和细胞分裂相关，Ptcra(?)区域与胸腺选择和炎症反应相关。

**2.9 胸腺与PBMC免疫组库比较揭示整体胸腺选择压力**

胸腺与PBMC共享约6%的克隆型（成熟克隆型）。共享克隆型富集于髓质，CDR3长度较短（14 vs 15），呈亲水性、低pI、小分子量和小残基尺寸。这些特征在scTCR-seq和人类数据中得到验证。

**2.10 胸腺阳性选择与阴性选择对免疫组库施加相反的选择压力**

阳性选择后，TCRβ CDR3疏水性增加，且克隆型增殖；阴性选择后，CDR3呈低疏水性、低pI、小分子量和小残基尺寸。衰老样本中阳性选择压力减弱，阴性选择特征稳定。

**2.11 基于TCR-seq的TCR成熟潜力评分系统**

利用bulk TCR-seq数据（训练集70%），整合110个TCR特征（CDR3长度、理化性质、氨基酸组成），构建单层逻辑回归模型。ROC曲线验证模型在空间TCR-seq和独立数据集中的准确性。成熟评分与pI、长度、疏水性和残基大小负相关，表明低pI、亲水性和小尺寸CDR3利于成熟。

**总结讨论**

研究人员通过整合多组学方法，首次构建了衰老小鼠胸腺的空间转录组和免疫组库图谱。研究揭示了胸腺皮质的异质性，发现了与祖细胞分化相关的新型皮质区域Cortex_0。空间TCR-seq阐明了TCR重组、配对和选择过程的空间动态，明确了胸腺选择压力对TCR克隆型理化性质的偏好（阳性选择偏爱疏水性CDR3，阴性选择偏爱亲水性和低pI CDR3）。衰老导致阳性选择压力减弱和胸腺结构分散。TCR成熟评分系统可预测TCR克隆型的成熟潜力。该研究为理解胸腺衰老、自身免疫和肿瘤免疫提供了空间维度的全新视角。研究结论：衰老过程中，胸腺阳性选择压力减弱，阴性选择压力相对增强，导致TCR克隆型呈现亲水性和低pI的CDR3特征，且增殖性CD69^negDN T细胞减少，调节性CD4^SP T细胞增加。Cortex_0是祖细胞分化的关键区域，其结构在衰老中受损。空间TCR-seq技术成功将免疫组库映射到组织空间，揭示了TCR克隆型在不同胸腺选择过程中的分布和动态变化。