对SHH信号和神经嵴介导的Gas1表达的差异敏感性调控发育和进化中的下颌大小

《Developmental Dynamics》：Differential sensitivity to SHH signaling and neural crest-mediated Gas1 expression regulate jaw size during development and evolution

　　

背景
下颌大小的发育调控对于预防出生缺陷和促进进化适应至关重要。研究人员已证明，下颌大小由神经嵴间充质（neural crest mesenchyme, NCM）决定，这些祖细胞迁移至下颌原基并形成下颌。NCM依赖包括Sonic Hedgehog（SHH）在内的多条信号通路来介导与下颌上皮的相互作用并促进下颌向外生长。研究人员探究了NCM介导的SHH通路调控是否构成下颌大小物种特异性进化的基础。

结果
研究人员分析了SHH通路成员随时间表达的变化，发现生长停滞特异性1（Growth Arrest-Specific 1, GAS1），一种SHH共受体，在鸭下颌原基中的表达量相较于鹌鹑高出20-75倍。研究人员制作了鹌鹑-鸭嵌合体，并证明Gas₁表达受NCM调控。功能获得和功能丧失实验揭示了物种特异性对SHH信号的敏感性，尤其是针对Gas₁。在NCM中过表达和敲低Gas₁会改变细胞数量和下颌大小，并差异性地影响涉及SHH和WNT通路、细胞周期等的基因。研究人员还发现了鸭和鹌鹑之间Gas₁启动子和编码序列的有趣差异。

结论
研究人员的工作表明，Gas₁表达和功能的变化可能调控发育、疾病和进化过程中的下颌大小。

本研究聚焦于下颌大小在发育和进化中的调控机制，背景在于下颌大小的异常可导致出生缺陷，而物种间的下颌大小差异是进化适应的重要表现。此前研究已确认神经嵴间充质（NCM）是下颌祖细胞，其迁移至下颌原基并决定下颌大小，但NCM如何通过分子通路实现物种特异性大小调控尚不明确。Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在协调上皮-间充质相互作用和促进下颌生长中起关键作用，但其共受体Gas₁在物种特异性大小调控中的角色未被探索。因此，研究人员以鸭（大下颌）和鹌鹑（小下颌）为模型，探究SHH通路及Gas₁的差异调控是否构成下颌大小物种特异性的基础。该研究发表于《Developmental Dynamics》。

研究人员采用的关键技术方法包括：利用定量PCR（qPCR）分析SHH通路成员在不同发育阶段（HH15–HH27）的表达；通过原位杂交（whole mount in situ hybridization）观察Gas₁的空间表达模式；构建鹌鹑-鸭嵌合体（quck）以评估NCM对基因表达的调控；使用环巴胺（cyclopamine）和重组SHH蛋白（rSHH）处理下颌原基外植体，检测物种特异性敏感性；通过体内电穿孔过表达Gas₁及吗啉代（morpholino）敲低，结合细胞计数和RNA-seq分析；对Gas₁启动子进行测序和转录因子结合位点（TFBS）预测；比较鸭和鹌鹑Gas₁编码序列（CDS）及蛋白质结构。样本来源为商业供应商提供的白羽鸭（Anas platyrhynchos）、日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）和罗德岛红鸡（Gallus gallus）胚胎。

研究结果如下：

**2.1 物种特异性大小差异在发育早期出现并进展**
通过细胞计数和模型分析，发现鸭下颌间充质细胞数量在HH18–HH27阶段平均比鹌鹑大4.1倍，模型预测与体内数据吻合，表明早期NCM迁移数量、细胞周期长度和绝对发育时间共同决定了物种特异性大小。

**2.2 SHH通路激活呈现阶段和物种特异性**
qPCR显示，9个SHH通路成员（Shh, Ptch1, Smo, Cdon, Boc, Gas1, Gli1, Gli2, Gli3）在HH15–HH18时鸭表达高于鹌鹑，但HH21–HH27时除Ptch1、Boc和Gas1外其余基因在鹌鹑中更高。Gas₁在鸭中始终高表达，相对差异达20–75倍。原位杂交显示Gas₁在鸭和鹌鹑下颌间充质中表达模式相似，但鸭中表达量更高，且主要在间充质而非上皮。

**2.3 NCM差异调控SHH通路成员**
鹌鹑-鸭嵌合体（quck）的qPCR分析表明，Gas₁和Gli1的表达表现为鹌鹑供体样（即受NCM调控），而Shh、Smo、Cdon、Boc等更接近鸭宿主（不受NCM调控）。Ptch1、Gli2、Gli3在两种阶段均呈不确定模式。

**2.4 鸭和鹌鹑下颌原基对SHH信号敏感性不同**
外植体培养实验显示，鸭对环巴胺（SHH抑制）有补偿性反应（上调Shh、Cdon、Gas1），而鹌鹑无此反应；鹌鹑对rSHH激活更敏感，从0.1 ng/mL开始下调Gas1，而鸭在所有浓度下均无显著变化。Gas1在物种间敏感性差异最大。

**2.5 Gas1表达变化影响体内下颌原基大小**
双侧电穿孔过表达Gas1后，鸭在HH21和HH24时下颌间充质细胞数减少；鹌鹑单侧过表达导致处理侧下颌变小。注射抗Gas1吗啉代后，鹌鹑处理侧下颌也变小，而对照吗啉代无影响。

**2.6 敲低和过表达Gas1导致差异基因表达**
RNA-seq分析显示，鸭中Gas1扰动导致752个差异表达基因（DE基因），其中322个仅由吗啉代引起，278个仅由过表达引起，152个共享；鹌鹑中590个DE基因，561个仅由吗啉代引起。基因本体（GO）富集分析表明，发育/分化、细胞周期、WNT信号通路等过程受显著影响。SHH通路成员中，鸭在两种处理下均改变Shh、Boc等；鹌鹑主要因吗啉代下调Shh和Gli基因。细胞周期基因中，鸭过表达上调Ccnb3和Ccnk，吗啉代上调Cdkn1A；鹌鹑吗啉代下调Ccni、上调Ccnl2。WNT通路基因在两种物种中均广泛改变。

**2.7 鸭和鹌鹑Gas1启动子存在差异**
启动子测序（翻译起始位点上游2 kb）发现，鸭具有一个约84–90 bp的特有插入，含有SP5/ZNF354C和IKZF2/ZNF263结合位点。鹌鹑特有TFAP2E、SMAD2、NKX2-3等结合位点。12个单核苷酸多态性（SNP）改变预测的TFBS，例如鸭中NR2C2变为鹌鹑中TFAP2E。鸭中多个与SHH响应相关的位点（如HIF1A、FOXN1、ZIC家族）为特有，而鹌鹑中NKX/ISL2、STAT簇、HES1等位点特有。

**2.8 鸭和鹌鹑Gas1蛋白存在差异**
克隆的CDS显示，鸭Gas1（1011 bp）比鹌鹑和鸡（942 bp）更长，编码蛋白质337个氨基酸（鹌鹑和鸡均为314个氨基酸）。鸭GAS1在N端、内部脯氨酸/谷氨酰胺富集区和中部甘氨酸/脯氨酸富集区有插入，且在保守区域存在氨基酸替换（如A→G、MAY→MTY等）。C端GPI锚定信号区域也有差异。人类和小鼠GAS1更长，但结构域架构保守。

讨论部分总结：研究结果表明，NCM通过调控SHH信号通路，尤其是Gas₁的表达和功能，驱动物种特异性下颌大小。早期发育参数（如NCM数量、细胞周期长度）的差异叠加Gas₁介导的SHH信号调谐，导致鸭和鹌鹑下颌大小的显著差异。Gas₁作为SHH共受体，其高表达可能缓冲和延长信号范围，促进鸭下颌间充质增殖；而鹌鹑中低表达则限制信号，促进早期分化。启动子和编码序列的物种特异性差异（如鸭特有插入、TFBS差异）为Gas₁表达和功能的进化提供了分子基础。Gas₁扰动还影响WNT通路和细胞周期调控，但不同物种采用不同的网络架构和缓冲策略。研究结论翻译如下：研究人员的工作表明，Gas₁表达和功能的变化可能调控发育、疾病和进化过程中的下颌大小。