《Microchemical Journal》：Development and validation of a solid-phase extraction UHPLC-MS/MS method for cylindrospermopsin determination in serum and urine
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•首个经验证的用于检测血清和尿液中CYN含量的UHPLC–MS/MS方法。•优化的SPE技术可确保高回收率并降低基质干扰。•该方法灵敏度极高，两种样本中的检测限和定量限都非常低。•该方法的精度、准确度和稳定性均符合AOAC标准。•已成功应用于检测接触过CYN的Wistar大鼠的毒
• 首个经验证的用于检测血清和尿液中CYN含量的UHPLC–MS/MS方法。
• 优化的SPE技术可确保高回收率并降低基质干扰。
• 该方法灵敏度极高，两种样本中的检测限和定量限都非常低。
• 该方法的精度、准确度和稳定性均符合AOAC标准。
• 已成功应用于检测接触过CYN的Wistar大鼠的毒代动力学研究。
引言 蓝细菌，又称蓝绿藻，是能产生氧气的细菌，其光合作用对地球大气的氧化过程起着关键作用。尽管这类微生物在生态系统中具有重要意义，但它们有时会形成密集的生物量，即蓝藻水华，进而产生多种有毒的次级代谢产物——蓝藻毒素。即便在自然浓度下，这些化合物也会对植物、动物乃至人类造成伤害[1]。此外，越来越多的证据表明，气候变化和富营养化现象正在导致蓝藻水华的发生频率和地理分布范围不断扩大，从而对公共健康构成日益严重的威胁[2]、[3]、[4]。
在蓝藻水华产生的各类蓝藻毒素中，有几种因其强大的生物活性以及对人类和环境健康的潜在影响而备受研究，包括微囊藻毒素（MCs）、结节藻素（NOD）、柱孢藻素（CYN）、鱼藤酮A（ATX）和石房蛤毒素（STX）[5]。
尤为值得关注的是CYN，因为它分布广泛且具有多种毒性作用机制[6]。这种毒素由多种蓝细菌属产生，包括Cylindrospermopsis raciborskii 、Umezakia ovalisporum （曾用名Aphanizomenon ovalisporum 和Anabaena bergii 、Aphanizomenon flos-aquae 以及。从化学结构上看，CYN是一种生物碱类细胞毒素，由三环胍基团、羟甲基尿嘧啶和硫酸盐组成，分子量为415?Da[5]、[7]。由于其可能影响多种生理系统，CYN的毒理学特性也得到了广泛研究。CYN可通过抑制蛋白质合成，产生细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、神经毒性、内分泌紊乱及发育异常等效应。此外，它还可能与细胞色素P450酶（CYP450）发生相互作用，引发氧化应激和DNA链断裂，与雌激素受体结合，并改变乙酰胆碱酯酶的活性，这说明它的作用靶点和作用机制十分多样[6]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
鉴于CYN具有多种毒性作用，人们越来越担心它对人类健康的潜在危害，因为人们可能通过受污染的饮用水、娱乐活动或食物摄入此类毒素，尤其是由于CYN可能在植物、水生生物及食物链中发生生物积累[14]、[15]、[16]、[17]。为应对这些风险，监管机构提出了多项针对CYN的指导值。世界卫生组织规定，CYN的临时每日允许摄入量为体重每千克0.03?μg/天，终生饮用水标准值为0.7?μg?L?1 ，短期饮用水标准值为3?μg?L?1 ，娱乐用水标准值为6?μg?L?1 [6]。随着相关毒代动力学和暴露评估研究的深入，具备经过验证的分析方法变得极为重要。尤其是在分析复杂生物样本中的CYN时，必须充分考虑基质干扰，采用有效的净化方法，并基于加标样本进行准确的回收率测试[6]。
超高效液相色谱结合串联质谱技术（UHPLC-MS/MS）因其高灵敏度、高选择性以及适用于复杂基质的特点，成为检测和定量CYN的强大可靠方法。该技术已被广泛用于分析各种类型的样本，如水[18]、[19]、[20]，水生生物[21]、[22]，以及蔬菜[23]、[24]。因此，UHPLC-MS/MS是开发用于评估CYN暴露水平的分析方法的理想平台。
此外，样本预处理也是分析复杂生物样本的关键步骤，因为它有助于减少基质干扰，提升分析方法的效率与灵敏度。固相萃取（SPE）因能有效净化目标分析物如CYN而被广泛使用[25]、[26]。因此，优化后的SPE流程可通过减少干扰并提高灵敏度，显著提升UHPLC-MS/MS方法的整体性能[23]。
在各类与毒代动力学和暴露研究相关的生物样本中，血清和尿液因其易于获取而备受关注。鉴于CYN具有广泛的系统性作用，血清对于评估其在体内的分布情况尤为重要[27]。不过，尽管CYN具有重要的毒理学意义，但目前尚未通过高灵敏度技术在其血清中检测到该毒素。相反，通过放射性标记的CYN进行的研究表明，尿液是其主要排泄途径，部分毒素会以未代谢的形式排出，因而能够以原始形态被检测到[28]。尽管如此，目前仍缺乏将UHPLC-MS/MS技术应用于检测这些样本中CYN的方法，也尚无经过验证的相关技术。仅有一项研究尝试通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）建立检测人类血清和尿液中CYN的方法，但该方法的回收率、灵敏度和线性均未经过验证[29]。
基于以上情况，本研究的目的是尽我们所知，首次开发出一种完全经过验证的、用于检测和定量血清及尿液中CYN的分析方法。该方法结合了针对特定基质的样本前处理、石墨化碳SPE净化技术以及UHPLC-MS/MS检测手段，可实现高效且灵敏的检测。方法验证是按照国际标准进行的[30]，评估了方法的回收率、线性、灵敏度、基质干扰程度、检测限和定量限等指标。
章节摘要 试剂与化学品 纯度为95%的CYN标准品购自Enzo公司（瑞士劳森）。CYN的标准溶液首先在Milli-Q水中配制，浓度为5?μg?mL?1 ，随后稀释得到浓度范围在1至500?μg?L?1 之间的工作溶液。虽然本研究并未检测CYN的稳定性，但我们的研究小组此前已证明，在生物学相关的条件下，这种蓝藻毒素具有很高的稳定性。在最近一项利用大鼠和人类肝脏微粒体开展的研究中
结果与讨论 据我们所知，本研究首次开发出一种完全经过验证的分析方法，可利用SPE和UHPLC-MS/MS技术检测大鼠血清和尿液中的CYN。后续章节将介绍该方法的校准性能、准确度和稳健性，以及其在实际样本中的应用情况。
结论 本研究提出了一种经过全面验证的分析方法，可用于检测大鼠血清和尿液中的CYN，该方法结合了针对特定基质的样本前处理、石墨化碳SPE净化技术以及UHPLC-MS/MS检测手段。该方法表现出优异的线性（1–500?μg?L?1 ），极低的检测限和定量限，且基质干扰较小。其精密度（血清为7.51–12.47%，尿液为2.36–6.41%）和回收率（血清为94.52–101.71%，尿液为74.96–98.81%）均符合AOAC标准，同时稳健性评估也显示该方法表现良好
CRediT作者贡献说明 Ronald F. Borja： 撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学，实验研究，数据整理。Antonio Cascajosa-Lira： 撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，方法学，实验研究，正式分析，数据整理，概念设计。Remedios Guzmán-Guillén： 撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督指导，方法学，实验研究，正式分析，数据整理，概念设计。Leticia Diez-Quijada： 撰写——初稿，
利益冲突声明 作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：Angelas Jos表示获得了西班牙科学创新与大学部的财政支持；Ana I. Prieto也表示获得了同一机构的财政支持；Ronald F. Borja同样表示获得了该机构的资助。如有其他作者，则请一并说明
致谢 作者感谢MICIU/AEI/
10.13039/501100011033 以及FEDER对该项目的支持，项目编号为PID2023-147444OB-I00。R.F.B.还感谢西班牙MICIU提供的PREP-2023-001191号预博士奖学金。此外，塞维利亚大学的第七项自主研究计划（VII PPTI-US）也为该研究提供了通用研究服务（I.3）方面的支持，CITIUS机构也为本研究作出了重要贡献。
Ronald F. Borja|Antonio Cascajosa-Lira|Remedios Guzmán-Guillén|Leticia Diez-Quijada|Rosario Moyano-Salvago|Ana M. Cameán|Angeles Jos|Ana I. Prieto
