《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Effector gene-based diagnostic assay for the precise detection of yellow rust infection in wheat
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摘要由Puccinia striiformis f. sp. tritici（简称）引发的条锈病仍是制约小麦产量的重要因素，因此需要快速准确的检测方法来有效控制该病害。本研究开发了一种基于效应子介导的诊断方法，以属的NPR1互作蛋白（PNPi）基因为靶标，用于精准检测小麦中的条锈
摘要
由
Puccinia striiformis f. sp.
tritici（简称
）引发的条锈病仍是制约小麦产量的重要因素，因此需要快速准确的检测方法来有效控制该病害。本研究开发了一种基于效应子介导的诊断方法，以属的NPR1互作蛋白（PNPi）基因为靶标，用于精准检测小麦中的条锈病感染情况。研究设计了特异性引物，可扩增单拷贝的PNPi效应子基因的146 bp片段。该检测方法具有高度特异性，能够成功扩增所有检测到的印度条锈病病原株，且与其他锈病病原体或42种非目标真菌无交叉反应。所开发的PCR检测方法可在接种后5天就能在小麦叶片样本中可靠地检测出病原体，证明了其在早期诊断中的实用性。此外，经过优化的基于SYBR Green的定量PCR检测方法也表现出良好的线性关系（R2?>?0.989），其检测限低至0.007?ng?μL?1。田间试验表明，病原体数量与病害严重程度之间存在密切关联，Cq值与感染程度呈负相关。总体而言，基于效应子的qPCR检测方法是一种快速、灵敏且高度特异的工具，可用于条锈病的早期检测和定量分析，从而有助于改进病害监测和管理策略。引言
小麦（
Triticum aestivum L.）是一种重要的粮食作物，对全球粮食和营养安全有着重要意义。然而，由其引起的条锈病却严重限制了小麦的产量，这种病害是由专性生物寄生真菌
Puccinia striiformis f. sp.
tritici（简称
）引发的，这类真菌在寒冷潮湿的环境中生长旺盛[1,2]。该病原体可在小麦生长的各个阶段进行感染，会形成特征性的黄橙色夏孢子堆，通常在感染后10–15天会出现可见症状[3,4]。在全球范围内，条锈病造成了巨大的产量损失，使得许多小麦种植区面临风险[1,5,6]。该病害在世界各地多次引发大规模流行，尤其在2009–2010年间，中东和地中海地区爆发了极为严重的疫情，造成了严重的经济损失和产量大幅下降。据估计，全球范围内，条锈病每年给小麦种植区带来的产量损失约为547万吨[6]。在印度，条锈病在北部平原和喜马拉雅山麓地区频繁发生，每年影响近1000万公顷的农田，在条件极为有利的情况下，会导致4%的产量损失甚至全株死亡[5,7]。过去的疫情，如2008–2009年旁遮普地区PBW 343品种的严重发病情况，都凸显了该病害的破坏力以及持续监测的必要性[8]。及时准确地检测
对于有效预测和管理该病害至关重要[[9], [10], [11]]。传统的诊断方法依赖症状观察和实验室确认，但在病原体初期侵染时效率较低且不可靠，因为此时病原体尚未表现出症状[12,13]。此外，Pst属于专性生物寄生真菌，无法在人工培养基上生长，因此必须在宿主组织中进行直接检测[14]。分子检测技术，尤其是基于聚合酶链反应的检测方法，提高了检测的灵敏度和特异性，还能识别潜伏性感染[[15], [16], [17], [18]]。定量PCR技术则进一步提升了病原体检测的灵敏度和定量准确性，便于为流行病学研究和抗性筛选提供精确的病原体负荷数据[19,20]。尽管有了这些进展，目前大多数基于PCR的检测方法仍以基因组中的内部转录间隔区、β-微管蛋白或序列特征扩增区等标记作为检测靶标。但这些标记存在诸多局限性，比如容易与相近的锈病物种发生交叉扩增，不同遗传背景的病原体群体间检测灵敏度差异较大，且对地区性不同的病原株特异性较低[[20], [21], [22], [23], [24]]。这些局限性凸显出需要寻找既高度特异又具有生物学意义的诊断靶标，以便在各种环境中实现可靠的早期检测。病原体效应子是一类小型分泌蛋白，它们通过调控植物的免疫反应来帮助病原体在宿主体内定植，因此成为分子诊断领域的理想靶标[25]。由于这些效应子在病原致病性中起着重要作用，且具有独特的病原体特异性基因组特征，它们为传统分子标记提供了更具生物学依据的替代方案。在本研究中，选择
属的NPR1互作蛋白（PNPi）效应子基因作为诊断靶标，因为它是一种功能已明确的单拷贝基因，在所研究的P. striiformis f. sp. tritici不同菌株中均存在，这一特性保证了检测的高特异性、稳定的扩增效果以及准确的病原体定量结果。同时，该基因与小麦基因组或其它相近的小麦锈病病原体，如P. graminis f. sp. tritici和，均无显著同源性[[25], [26], [27], [28]]。与来自保守基因组区域或匿名基因组片段的ITS、SCAR和β-微管蛋白标记不同，PNPi效应子直接与病原体的毒力相关，且对P. striiformis f. sp. tritici具有高度的序列特异性。因此，它能有效降低与其它相似锈病病原体的交叉反应风险，提高诊断的特异性。此外，由于效应子基因在病原体侵染早期就会表达，以PNPi作为检测靶标能够在病原体数量较少、尚未出现明显病害症状时实现灵敏可靠的检测，非常适合用于早期疾病诊断。另外，该基因在侵染过程中会在宿主组织中表达，这也进一步证明了它作为分子靶标的生物学合理性[25,29]。基于这些特点，本研究评估了PNPi效应子基因在特异性检测和定量分析P. striiformis f. sp. tritici方面的适用性。因此，本研究的目标是确定与感染小麦的其他相关真菌物种之间的效应子基因差异，开发基于PNPi效应子基因的快速且特异的qPCR检测方法，验证该方法对非目标真菌及其他锈病病原体的特异性，测定病原体负荷与病害严重程度之间的关系，以及评估该方法在自然感染小麦样本中的稳定性。章节节选
真菌分离株与基因组DNA提取
本研究共使用了50株真菌分离株（见表S1）。这些分离株包括18种小麦锈病病原株，其中8种为条锈病病原株（110S119、111S68、238S119、110S84、6S0、47S103、46S103和46S119），5种叶锈病病原株（77-5、77-9、104-2、12-5和77-1），以及5种秆锈病病原株（40A、11、117-6、21A-2和122）。其余的分离株则来自……
引物特异性的确定
PNPi引物对（PNPi 1F/PNPi 1R；见表1）被设计用于扩增
Puccinia striiformis f. sp.
tritici（简称
）效应子基因的单拷贝版本的146 bp片段。该扩增产物的预期熔解温度为61.75°C。通过NCBI BLASTn（v2.14）分析发现，该片段与的序列具有100%的相同性，而与其他属物种、小麦（Triticum aestivum）或其他常见小麦病原体则没有显著相似性，这表明该引物对具有很高的计算机模拟特异性。使用PNPi引物对进行的常规PCR检测……讨论
分子诊断技术通过提供比传统形态学方法更高的灵敏度、特异性和检测速度，极大地推动了真菌病原体的检测工作[37,38]。在小麦条锈病防治中，及时准确地检测
Puccinia striiformis f. sp.
tritici（简称
）对于病害监测、抗性育种以及及时采取防控措施至关重要。因此，基于PCR和qPCR的检测方法变得不可或缺，因为它们能够可靠地检测出低浓度的病原体……结论
本研究开发了一种基于新型效应子基因（PNPi）的PCR和SYBR Green qPCR检测方法，可用于快速、灵敏且高度特异地检测小麦中的Puccinia striiformis f. sp. tritici。由于以单拷贝的PNPi效应子作为检测靶标，该方法能够准确检测各种印度条锈病病原株，且不会发生交叉反应。该检测方法在接种后5天即可实现可靠识别，其qPCR检测限低至0.007?ng?μL?1。病原体DNA含量与病害严重程度之间存在较强的相关性……
CRediT作者贡献说明
Shailja Gupta：概念构建、研究实施、方法设计、验证、初稿撰写。Prem Lal Kashyap：概念构建、资金获取、项目管理、资源协调、监督指导、审稿与编辑工作。Pradeep Sharma：监督指导、审稿与编辑工作。Vikas Gupta：数据分析、软件应用、结果可视化。Pramod Prasad：审稿与编辑工作。Arun Gupta：审稿与编辑工作。Rajender Singh：软件应用、结果可视化、审稿与编辑工作。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢ICAR在AMAAS网络项目“基于分子基因组学的实时监测小麦和大麦病原体的田间监测系统”（项目编号1002588）中提供的资金支持。
Shailja Gupta|Prem Lal Kashyap|Pradeep Sharma|Vikas Gupta|Pramod Prasad|Arun Gupta|Rajender Singh|Ratan Tiwari
ICAR-印度小麦与大麦研究所，哈里亚纳邦卡纳尔市，邮编132001，印度
