多伦多动物园15年木野牛（Bison bison athabascae）辅助生殖技术（ARTs）的经验教训

《Theriogenology Wild》：Lessons from 15 years of wood bison ( Bison bison athabascae) ARTs at Toronto Zoo

　　

在过去15年中，多伦多动物园开展了一项持续项目，以开发、实施和完善受威胁木野牛（Bison bison athabascae）的辅助生殖技术（ARTs）。研究人员回顾了2010年至2021年间发情同步和人工授精试验的结果，重点突出了技术里程碑和持续存在的挑战。方案在迭代修改后从家牛方案改编而来，以解决物种特异性生殖生理、季节性繁殖、应激敏感性和后勤挑战。在整个研究期间，这些努力产下了14头犊牛，包括首次报道的木野牛使用性别分选精子和冷冻保存35年的精子受孕。然而，成功率受到小样本量、受体可用性变化和激素方案反应不一致的限制。通过记录进展和局限性，这项工作展示了长期ART项目在野生动物保护中的可行性、动物园机构在维持这些项目中的关键作用，以及持续改进激素方案、精子冷冻保存技术和受体管理以改善受威胁物种生殖结果的重要性。

**研究背景、现存问题与研究意义**
木野牛（Bison bison athabascae）是北美最大的陆地哺乳动物，曾因过度狩猎、栖息地丧失和疾病濒临灭绝，通过数十年的保护、重引入和管理得以恢复，但仍被加拿大《濒危物种法案》列为受威胁物种。其长期存续面临种群碎片化、遗传多样性有限以及结核病和布鲁氏菌病等疾病爆发的威胁。木野牛是北方和亚北极生态系统的关键物种，其放牧和活动模式影响植被结构、种子传播和其他物种的栖息地可用性，同时具有重要的文化意义。因此，保护木野牛既是生态责任也是文化责任。
**研究人员开展的研究、结论与意义**
多伦多动物园开展了一项长期项目，以开发、实施和完善木野牛的辅助生殖技术（ARTs）。研究人员回顾性分析了2010年至2021年间8种发情同步和人工授精方案的结果，共对25头雌性木野牛进行了69次生殖操作，产下14头犊牛，包括首次使用性别分选精子和冷冻保存35年的精子成功受孕。研究结论：成功率受限于小样本量、受体可用性变化和激素方案反应不一致，但证明了长期ART项目在野生动物保护中的可行性，以及动物园机构在维持这些项目中的关键作用。该研究发表在《Theriogenology Wild》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用的关键技术方法包括：1）发情同步方案，使用孕酮释放装置（CIDR或PRID）结合前列腺素F_2α（PGF_2α）、马绒毛膜促性腺激素（eCG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）或促黄体激素（LH）进行卵泡波同步和排卵诱导；2）精液采集，通过电刺激采精法从University of Saskatchewan的Native Hoofstock Centre的成熟木野牛公牛获得；3）精液处理，包括新鲜冷却运输、冷冻-解冻（使用Triladyl、TEGY或OptiXcell等稀释液）以及性别分选（流式细胞术富集X染色体精子，纯度≥90%）；4）人工授精，在同步后定时进行，使用经直肠超声检查监测卵泡和排卵。样本来源包括多伦多动物园保护牛群（雌性17–22头，雄性4–9头）、University of Saskatchewan的研究牛群以及加拿大野生动物冷冻库的存档精液（CWB7，1980年冷冻）。
**研究结果**
**3.1 发情同步效率**
通过分析主导卵泡大小、黄体（CL）存在和卵巢囊肿发生率评估同步效率。线性模型显示方案对卵泡大小无显著影响（F=1.11，p=0.34），但方案1（14.4±5.8 mm）和方案3（12.8±4.5 mm）的卵泡平均直径超过排卵能力阈值（≥10 mm）。CL存在率在0%至64.7%之间，方案间无显著关联（χ2=44.21，df=4，p=0.14）。卵巢囊肿发生率低，方案间无显著差异（χ2=26.21，df=4，p=0.88）。数据缺失部分方案因后勤限制无法获取。
**3.2 发情同步方案对妊娠率的影响**
妊娠率在方案间从11%变化至67%，方案5（67%）和方案2（56%）最高，但二项逻辑回归模型仅显示微弱证据（方案2估计值=2.30，SE=1.26，p=0.067；方案5估计值=2.77，SE=1.62，p=0.087），Tukey校正后无显著差异。犊牛结局描述性差异（如方案1全为雌性，方案6全为雄性），但Fisher精确检验不显著（p=0.679），样本量过小无法得出稳健结论。
**3.3 公牛、精液储存方法和精子分选对妊娠率的影响**
常规精液妊娠概率高于性别分选精液，但差异不显著（估计值=0.53±0.84，p=0.52）。冷冻-解冻与新鲜冷却精液无显著差异（估计值=0.31±0.53，p=0.56）。公牛个体间妊娠概率差异明显（如公牛67、72、74>30%），但统计检验不显著。里程碑：使用冷冻35年精液（CWB7）产下一头犊牛，使用性别分选精子产下首头雌性犊牛（2021年），后重复成功（2022年和2025年）。
**讨论总结与结论翻译**
**讨论总结**：多伦多动物园的ART项目面临独特挑战，包括木野牛对操作的应激敏感性（高心率和呼吸频率、飞行反应）、化学保定导致的低氧血症和呼吸性酸中毒风险、季节性繁殖限制、后勤约束（户外操作、人员变动、动物体况过肥）以及伦理和机构考量（动物福利优先、公众透明度）。这些因素导致方案优化困难，小样本量和低重复性限制了统计效力。尽管如此，项目实现了重要里程碑，包括使用冷冻35年精液和性别分选精子产犊，证明了长期基因组资源库和机构间合作的价值。未来需要继续改进激素方案、精子冷冻保存和性别分选方法，以提升效率。
**研究结论翻译**：在过去的15年中，多伦多动物园木野牛辅助生殖技术（ARTs）的开发和完善通过人工授精产下了14头犊牛，对该物种的长期保存做出了重要贡献。这项工作取得了若干里程碑，包括使用冷冻35年的精子受孕，以及使用性别分选精子通过人工授精产下雌性犊牛。这些成就展示了先进ARTs在遗传管理和种群恢复优先物种中的技术可行性和保护价值。尽管取得了这些成功，妊娠率仍然多变，反映了在优化发情同步方案以及精液处理和冷冻保存方案方面持续存在的挑战。需要继续努力改进激素刺激方案，并使精子性别分选和冷冻保存方法适应木野牛精子生理学，以达到与家牛相当的效果。