埃塞俄比亚选定地区非洲马瘟病毒的分子检测

《Veterinary and Animal Science》：Molecular Detection of African Horse Sickness Virus from Selected Areas in Ethiopia

　　

马科动物对全球经济至关重要，并支撑着数百万人的生计。然而，其生产力和福利受到非洲马瘟（African Horse Sickness, AHS）等传染病的严重阻碍，这在埃塞俄比亚造成了重大的社会经济损失。研究人员于2022年11月至2023年5月开展了一项横断面研究，旨在从埃塞俄比亚流行地区的马科动物中分离和检测非洲马瘟病毒（African Horse Sickness Virus, AHSV）。总共从临床患病和近期死亡的动物中无菌采集了30份血液样本和2份代表性组织标本，并在冷链条件下运输至Bishoftu的国家兽医研究所。研究人员使用常规反转录聚合酶链反应（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）分析了共32份样本，靶向病毒蛋白7（Viral Protein 7, VP7）基因，以扩增所有血清型的第七片段，并使用血清群特异性引物。其中，7份样本（21.88%）在2%琼脂糖凝胶电泳上产生了102bp的片段。对于血清分型，研究人员进一步检测了这7份PCR阳性样本，靶向编码病毒蛋白2（Viral Protein 2, VP2）的基因，并使用血清型特异性引物，从组织样本中鉴定出血清型9，产生228bp条带。仅组织样本在Vero细胞上培养，表现出细胞病变效应，特征为细胞聚集、变圆和脱落。总之，由血清型9引起的非洲马瘟严重影响马科动物，并在马中导致高死亡率。通过疫苗接种进行战略性疾病控制至关重要，需要进一步研究以评估爆发潜力，并对马科动物和昆虫媒介中的病毒进行基因型鉴定。

非洲马瘟（African Horse Sickness, AHS）是一种由非洲马瘟病毒（African Horse Sickness Virus, AHSV）引起的严重虫媒病毒病，属于环状病毒属（Orbivirus），具有分节段双链RNA基因组，在易感马科动物中死亡率高，主要通过库蠓（Culicoides）传播。该病在撒哈拉以南非洲和东非部分地区呈地方性流行，全球存在9种血清型，但血清型间交叉保护有限，增加了防控难度。埃塞俄比亚拥有全球第二大马科动物种群，历史上多次爆发AHSV，已报道血清型2、4、6、8、9，其中血清型9最为常见。然而，系统监测和菌株水平鉴定仍存在空白，临床诊断不可靠，且多血清型可能共循环，导致疫苗选择困难。因此，研究人员开展本研究，旨在通过病毒学和分子方法分离和检测埃塞俄比亚选定地区的AHSV，并对循环株进行血清分型，以填补流行病学数据空白，支持基于证据的防控策略。研究于2022年11月至2023年5月进行，在埃塞俄比亚Oromia和Amhara地区7个爆发点（Liben Chukuala、Moretna Jiru、Negelle Arsi、Goro、Yabello、Kimbibit、Bacho）采集样本，共30份血液和2份组织（肺和脾），来自临床患病和近期死亡的马和驴。研究人员使用常规反转录聚合酶链反应（RT-PCR）靶向VP7基因进行病毒检测，阳性样本再通过VP2基因特异性引物进行血清分型，并尝试在Vero细胞上分离病毒。主要技术方法包括：样本来源为埃塞俄比亚Oromia和Amhara地区7个爆发点的马和驴；核酸提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit；检测采用一步法常规RT-PCR，靶向VP7基因（通用引物，扩增片段102bp）；血清分型靶向VP2基因（血清型2、4、9特异性引物）；病毒分离在Vero细胞上进行，观察细胞病变效应。
**4.1 临床和尸检发现**
通过临床检查，研究人员观察到疑似AHS的马科动物出现发热、呼吸困难、泡沫状鼻液、抑郁、出汗和头部水肿等常见症状。对Adulala镇两匹死亡马匹的尸检显示典型AHS病变，包括严重肺充血和水肿、泡沫状呼吸道渗出液伴胸腔积液，以及脾脏、心脏和肠浆膜的瘀点出血。
**4.2 分子检测结果及相关风险因素**
研究人员使用常规RT-PCR靶向VP7基因，对32份样本进行检测。结果显示，7份样本（21.88%）阳性，其中5份血液样本（16.7%）和2份组织样本（100%）扩增出102bp片段。风险评估因素分析（Pearson卡方检验或Fisher精确检验）表明，仅年龄与AHSV检测显著相关（p=0.001），老年马科动物（>10岁）阳性率最高（75%，6/8），成年马（4-10岁）阳性率6.7%（1/15），幼年马（≤4岁）无阳性；而物种、性别、临床形式、地区和季节无显著关联。
**4.3 AHSV血清分型**
研究人员对7份阳性样本进一步使用靶向VP2基因的RT-PCR检测血清型2、4、9。仅组织样本（肺和脾）扩增出约228bp条带，确认为AHSV血清型9；其余5份血液样本未扩增出血清型2、4、9的条带，提示可能属于其他血清型。
**4.4 Vero细胞上的细胞病变效应**
将7份PCR阳性样本接种于Vero细胞单层后，仅组织样本在第二次盲传后观察到细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、死亡细胞聚集、从单层脱落，最终单层完全破坏；血液样本未显示CPE。阳性培养物经常规RT-PCR确认。
**讨论**：研究讨论指出，AHS在埃塞俄比亚呈地方性流行，RT-PCR检测阳性率（21.88%）相对低于既往报告，可能归因于爆发地区马科动物曾接种疫苗，导致病毒载量降低。年龄因素中，老年动物感染率较高，可能与长期疫苗接种导致免疫无应答或超敏反应有关。血清分型确认血清型9最为普遍，与既往研究一致。病毒分离成功仅来自组织样本，而血液样本阴性，可能与采样时机、病毒载量低或储存条件有关。研究强调，分子检测与病毒分离结合使用可增强诊断可靠性，并呼吁加强分子监测和血清分型。
**结论**：非洲马瘟是限制马科动物生产力和福利的主要因素之一，对国家造成重大社会经济影响。本研究揭示了不同研究区域循环AHSV的相对高流行率。本研究还通过分子和病毒学技术确认了AHSV血清型9，已知在Liben Zikuala地区循环，并导致最严重的呼吸和循环障碍，进而导致马死亡。