《The Veterinary Journal》：Development and Validation of PCR–RFLP Assays for Detection of MYBPC3 Variants Associated with Hypertrophic Cardiomyopathy in Maine Coon and Ragdoll Cats
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摘要肥厚型心肌病是家猫中最常见的肌脏疾病，已有研究表明缅因库恩猫和 Ragdoll 猫的 MYBPC3 基因存在与品种相关的变异。本研究开发了两种聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测方法，用于检测缅因库恩猫的 MYBPC3 c.91G>C（A31P）变异以及 Ragdoll 猫
摘要
肥厚型心肌病是家猫中最常见的肌脏疾病，已有研究表明缅因库恩猫和 Ragdoll 猫的 MYBPC3 基因存在与品种相关的变异。本研究开发了两种聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测方法，用于检测缅因库恩猫的 MYBPC3 c.91G>C（A31P）变异以及 Ragdoll 猫的 c.2453C>T（R820W）变异，并将这些检测方法应用于越南的一小群猫咪，同时进行超声心动图检测。研究共检测了25只缅因库恩猫和34只 Ragdoll 猫，首先排除其他导致心肌肥厚的因素，再根据左心室壁厚度等超声心动图指标对它们进行分类。A31P变异检测产生的128bp扩增产物可用HaeIII酶消化，而R820W变异检测产生的319bp扩增产物则可用BccI酶消化。限制酶消化结果与计算机预测及典型的Sanger测序结果一致。在25只缅因库恩猫中有3只检测出杂合子携带者（占比12%，突变等位基因频率为0.06），在34只Ragdoll猫中有3只检测出杂合子携带者（占比8.8%，突变等位基因频率为0.044）；未发现纯合子突变猫。两个品种中各有一只杂合子猫出现临床肥厚型心肌病症状，但费希尔精确检验并未发现基因型与心肌病之间的关联。杂合子猫在部分超声心动图指标上存在差异。这些研究结果表明，在资源有限的实验室环境中，PCR-RFLP方法可用于MYBPC3基因的靶向分型，但由于样本量较小，无法用于评估疾病外显率、预测临床风险或推断群体中的等位基因频率。
引言
肥厚型心肌病是家猫中最常见的肌脏疾病，其特征为左心室心肌出现同心性肥厚，且不存在系统性高血压、甲状腺功能亢进或主动脉狭窄等其他致病因素。该疾病的临床表现多样，可从无临床症状的超声心动图异常发展到充血性心力衰竭、动脉血栓栓塞甚至猝死。流行病学研究发现在看似健康的猫中也存在心肌病表现，而某些品系中该病的高发现象也表明其具有遗传因素（Ferasin等人，2003；Payne等人，2015；Luis Fuentes等人，2020）。
分子生物学研究已在某些猫品种中发现心脏肌球蛋白结合蛋白C基因（MYBPC3）的变异。在缅因库恩猫中，c.91G>C变异会导致A31P氨基酸替换，该变异与家族性肥厚型心肌病相关（Meurs等人，2005）；纯合子猫的发病率和病情严重程度通常更高，而杂合子猫的发病率较低，尤其在幼年时期（Wess等人，2010；Godiksen等人，2011；Longeri等人，2013）。在Ragdoll猫中，MYBPC3 c.2453C>T变异会导致R820W氨基酸替换，该变异与肥厚型心肌病相关，纯合子猫的存活率显著降低，而杂合子猫的存活率与野生型猫相当（Meurs等人，2007；Borgeat等人，2014）。这些先前的研究为基于基因型的风险分层提供了依据，而小型本地研究群体则可作为补充性的区域数据参考。
目前一些地区的专业兽医遗传学实验室可提供针对这些MYBPC3变异的常规基因分型服务，但在资源匮乏地区的许多兽医学校和科研机构，仍难以获得商业检测平台或测序服务。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测是一种针对已知序列变异的低成本检测方法，只需常规热循环仪、限制性酶和琼脂糖凝胶电泳即可完成。因此，在缺乏可靠参考基因分型服务的情况下，PCR-RFLP方法可用于科研中的变异确认或作为初步监测手段，但它不能替代经过验证的商业或参考实验室检测方法。
在报告基因型与表型之间的关联数据时，准确的表型分类至关重要。超声心动图仍是描述猫心肌病表型的主要无创方法，可通过该技术检测左心室壁厚度、心腔尺寸、左心房大小以及功能参数（Luis Fuentes等人，2020）。先前使用组织多普勒成像对缅因库恩猫的研究表明，即使在无明显心肌肥厚的情况下，基因型阳性的猫，包括杂合子猫，也存在收缩期和舒张期功能异常；这一现象最初在一篇病例报告中得到证实（Chetboul等人，2006），随后在A31P杂合子猫群体中得到了进一步验证（Sampedrano等人，2009）。
本研究的假设是：与Sanger测序相比，PCR-RFLP方法能够准确区分A31P和R820W这两种MYBPC3基因型；在越南的本地猫群体中，基因型阳性的猫在超声心动图指标上可能与野生型猫存在差异。研究目的是开发并评估用于检测MYBPC3 c.91G>C和c.2453C>T变异的PCR-RFLP检测方法，将其应用于越南的缅因库恩猫和Ragdoll猫，同时描述这一小型横断面研究群体中的超声心动图检测结果，但不评估疾病外显率或临床风险。
章节节选
动物伦理
所有猫的处置均遵循越南相关的动物健康和畜牧管理法规。研究对象为宠物主人自愿参与的缅因库恩猫和Ragdoll猫，研究开始前已向主人说明研究目的、采血流程、超声心动图检查以及基因和临床数据的用途。在采集样本前，已获得所有主人的书面知情同意。研究的实施还得到了伦理监管机构的监督和认可。
针对猫MYBPC3变异的PCR-RFLP检测方法的开发
本研究成功开发了两种PCR-RFLP检测方法，用于检测与肥厚型心肌病相关的猫MYBPC3变异，即缅因库恩猫的c.91G>C（A31P）变异和Ragdoll猫的c.2453C>T（R820W）变异。通过对每个多态性位点两侧序列的分析，选择了适合特定扩增的引物对，以及能够生成反映基因型特征的消化图谱的限制性酶。对于A31P变异，可产生128bp的扩增产物，选用HaeIII酶进行消化。
PCR-RFLP检测方法的性能评估
本研究开发了两种PCR-RFLP检测方法，分别用于检测缅因库恩猫和Ragdoll猫的MYBPC3 c.91G>C和c.2453C>T变异。计算机预测的限制性酶消化图谱、琼脂糖凝胶电泳结果与典型的Sanger测序结果一致，这证明了这两种方法在单个实验室环境中的可行性。通过常规PCR、酶消化等操作即可实现基因型区分。
结论
综上所述，本研究开发了两种PCR-RFLP检测方法，用于检测缅因库恩猫和Ragdoll猫的MYBPC3 c.91G>C（A31P）和c.2453C>T（R820W）变异，且在本实验室中，限制酶消化结果与典型Sanger测序结果一致。在越南的本地研究群体中，仅检测到野生型和杂合子基因型，两个品种中各有一只杂合子猫出现临床肥厚型心肌病症状；费希尔精确检验未发现基因型与心肌病之间的关联。
关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本手稿的过程中，使用了生成式AI工具，尤其是ChatGPT（OpenAI），协助进行英文编辑、翻译和语法修正。所有内容均经过作者们的仔细审核并获得认可，最终文本的真实性仍由作者们全权负责。
利益冲突声明
作者们声明，自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者们感谢MEGA Veterinary Equipment Corporation提供用于本研究的超声诊断系统，同时也衷心感谢所有参与这项研究的兽医诊所和猫繁殖者。
Thao Phuong Vu|Thong Quang Le|Truc Thi Thanh Truong|Giang Thi Cam Nguyen|Khe Bich By|Cuong Ngoc Duong|Dai Van Nguyen|Khoa Hoang Dang Le|Anh Phu Nam Bui
越南胡志明市开放大学生物技术学院动物遗传学小组，胡志明市，越南
