《Brain Research Bulletin》：Receptor-interacting Protein Kinase 1 Regulates Microglial Polarization via the Csf3-JAK2/STAT3 Axis in Lipopolysaccharide-Induced inflammation and Lysolecithin-Induced Demyelination
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本研究采用整合遗传与药理学策略，利用RIPK1（受体相互作用蛋白激酶1）条件性敲除小鼠和抑制剂Nec-1s，在体内（LPC（溶血卵磷脂）诱导的脱髓鞘模型）和体外（LPS（脂多糖）刺激的原代小胶质细胞和BV2细胞）系统中，证明RIPK1的基因缺失或药理学抑制显著
本研究采用整合遗传与药理学策略，利用RIPK1（受体相互作用蛋白激酶1）条件性敲除小鼠和抑制剂Nec-1s，在体内（LPC（溶血卵磷脂）诱导的脱髓鞘模型）和体外（LPS（脂多糖）刺激的原代小胶质细胞和BV2细胞）系统中，证明RIPK1的基因缺失或药理学抑制显著减弱了M1小胶质细胞极化程序，并抑制了关键促炎细胞因子的产生。在机制上，研究人员鉴定出一条新的信号轴，其中RIPK1通过调控Csf3（集落刺激因子3，也称G-CSF）的表达来调控小胶质细胞极化。研究人员进一步证实Csf3作为JAK2（Janus激酶2）-STAT3（信号转导及转录激活因子3）通路的上游激活因子，而该通路是M1转录程序的经典驱动因素。综上所述，研究结果不仅确立RIPK1是将脱髓鞘与小胶质细胞持续介导的神经炎症联系起来的关键分子开关，还揭示了一条新的RIPK1/Csf3/JAK2-STAT3信号轴，该轴代表了脱髓鞘疾病的一个有前景的治疗靶点。
**论文解读**
**1. 研究背景、现存问题与研究动机**
中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病，如多发性硬化（MS），以进行性髓鞘破坏和内源性修复机制失效为特征。在此病理背景下，CNS驻留的小胶质细胞作为核心调控者，通过其动态极化过程塑造损伤微环境。在稳态下，小胶质细胞通过产生神经营养因子、支持神经元存活和清除细胞碎片来维持组织完整性。然而，在急性或慢性损伤刺激下，它们可向促炎性M1表型（表面标志物为CD86、CD16/CD32，并诱导一氧化氮合酶iNOS）转化，释放大量细胞毒性介质（如TNF-α、IL-1β），导致慢性神经炎症，直接损伤神经元并阻碍髓鞘再生。相反，IL-4和IL-13等细胞因子可诱导抗炎性M2表型（高表达CD206和Arg-1），通过促进炎症消退和组织修复来支持髓鞘再生。因此，M1/M2表型的功能平衡是关键生物学开关，调控此轴成为脱髓鞘疾病的合理治疗策略。
受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为细胞死亡和炎症的关键上游调控因子。其活性通过翻译后修饰精确控制，异常调控与MS、阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）及缺血性卒中等多种神经系统疾病相关。先前研究已表明RIPK1参与小胶质细胞活化和神经炎症，且研究人员前期工作发现遗传或药理学抑制RIPK1激酶活性可显著增强溶血卵磷脂（LPC）诱导的局灶性脱髓鞘模型中的髓鞘再生。但RIPK1如何调控小胶质细胞极化及其分子机制尚不明确。此外，集落刺激因子3（Csf3，即G-CSF）及其受体（Csf3R）在神经免疫中的作用日益受到关注，其可通过JAK/STAT轴调节巨噬细胞极化。因此，本研究旨在阐明RIPK1调控小胶质细胞极化的具体分子通路，并探索其作为脱髓鞘疾病治疗靶点的潜力。
**2. 研究概述与结论**
研究人员采用整合遗传学与药理学策略，利用RIPK1
D138N激酶失活敲入小鼠和特异性抑制剂Nec-1s，在体外（LPS刺激的BV2细胞系和原代小胶质细胞）及体内（LPC诱导的脱髓鞘模型）系统中，证明了RIPK1激酶活性抑制可选择性减弱M1小胶质细胞极化，而不影响M2抗炎表型。通过转录组测序（RNA-seq）筛选出Csf3为RIPK1的下游关键靶基因，进一步验证了RIPK1通过Csf3激活JAK2/STAT3通路来驱动M1极化。该研究揭示了RIPK1/Csf3/JAK2/STAT3信号轴在脱髓鞘疾病中的新作用，为靶向治疗提供了理论基础。论文发表在《Brain Research Bulletin》。
**3. 主要关键技术方法**
研究采用以下关键技术方法（样本来源包括C57BL/6小鼠和RIPK1
D138N激酶失活敲入小鼠，由浙江大学提供；原代小胶质细胞分离自出生后0-2天SD大鼠大脑皮层）：(1) 体外LPS刺激BV2小胶质细胞系和原代小胶质细胞，结合RIPK1抑制剂Nec-1s处理，评价小胶质细胞极化状态；(2) 体内建立LPC诱导的鼠胼胝体局灶性脱髓鞘模型，在病变后3、5、10天进行免疫荧光染色分析；(3) 转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析（KEGG、GSEA富集分析）鉴定差异表达基因；(4) Western blot、RT-qPCR、ELISA和Griess实验检测蛋白及mRNA表达水平、细胞因子分泌和一氧化氮水平；(5) 外源性重组Csf3（rmG-CSF）回补实验验证信号通路。
**4. 研究结果**
**4.1 Nec-1s抑制LPS诱导的BV2细胞M1小胶质细胞极化和促炎基因表达**
免疫荧光和Western blot显示，Nec-1s浓度依赖性地降低LPS诱导的iNOS阳性细胞比例及iNOS蛋白水平，并抑制M1标志物（CD32、iNOS）及促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的mRNA和蛋白表达，同时减少一氧化氮（NO）释放。
**4.2 Nec-1s不影响IL-4诱导的BV2细胞M2小胶质细胞极化**
在IL-4诱导的M2极化模型中，Nec-1s处理未改变Arg1阳性细胞比例、Arg1蛋白水平及M2相关基因（Arg1、CD206）的mRNA表达，表明RIPK1抑制选择性作用于M1通路。
**4.3 Nec-1s抑制LPS诱导的原代小胶质细胞M1极化**
在原代培养的大鼠小胶质细胞中，Nec-1s同样显著降低LPS诱导的iNOS阳性细胞比例、iNOS荧光强度、iNOS蛋白水平及NO产生，验证了体外结果的普适性。
**4.4 RIPK1抑制在LPC注射小鼠脑内3或5天时影响小胶质细胞极化**
在LPC诱导的脱髓鞘模型中，RIPK1
D138N突变小鼠在病变后3天和5天时，Iba1
+小胶质细胞总数不变，但M1标志物CD16/CD32阳性细胞比例及M1极化细胞比例显著低于野生型小鼠。
**4.5 RIPK1抑制在LPC注射小鼠脑内10天时影响小胶质细胞极化**
在10天时，RIPK1
D138N小鼠仍维持M1极化的持续抑制，且M2标志物CD206阳性细胞比例及M2极化细胞比例与野生型无显著差异，进一步证实RIPK1特异性调控M1而非M2表型。
**4.6 Nec-1s减弱LPS诱导的Csf3转录上调**
RNA-seq分析显示，Nec-1s处理显著抑制LPS激活的坏死性凋亡、NF-κB、TNF信号及细胞因子-受体相互作用等通路。差异表达基因（DEGs）筛选发现Csf3显著下调，RT-qPCR和Western blot验证了Nec-1s浓度依赖性地抑制LPS诱导的Csf3 mRNA和蛋白表达。
**4.7 RIPK1通过Csf3/JAK2/STAT3通路介导M1小胶质细胞极化的抑制**
Western blot显示，LPS上调Csf3和iNOS表达，并增加JAK2和STAT3的磷酸化水平，这些效应被Nec-1s抑制。外源性Csf3（rmG-CSF）处理可逆转Nec-1s对Csf3、iNOS表达及JAK2/STAT3磷酸化的抑制作用，证明Csf3是RIPK1下游的关键效应分子。
**5. 讨论与结论总结**
讨论部分指出，神经炎症是CNS脱髓鞘疾病的关键驱动因素，小胶质细胞M1/M2极化平衡决定修复结局。RIPK1在多种CNS细胞中广泛表达，其激酶活性参与AD、MS、ALS等疾病。本研究首次在体内外证实RIPK1抑制特异性减弱M1极化而不影响M2状态，并通过转录组学鉴定Csf3为关键下游分子，进一步揭示RIPK1通过Csf3激活JAK2/STAT3通路调控M1极化。虽然RIPK1调控Csf3的精确机制（直接转录调控或间接通过NF-κB/MAPK通路）尚需探索，但本研究提出的RIPK1/Csf3/JAK2-STAT3轴为脱髓鞘疾病提供了新的治疗靶点。
研究结论部分翻译如下：
综上所述，通过整合体外和体内分析，研究结果表明，RIPK1在LPS诱导的炎症和LPC诱导的脱髓鞘条件下，对小胶质细胞极化发挥关键调控作用。该调控效应归因于RIPK1通过Csf3触发的JAK2-STAT3信号通路调控小胶质细胞M1极化。值得注意的是，这是首次揭示RIPK1对Csf3依赖性小胶质细胞极化的控制，从而提出RIPK1/Csf3/JAK2-STAT3轴作为脱髓鞘疾病的新型有前景的治疗靶点。然而，RIPK1通过Csf3调控JAK/STAT通路和小胶质细胞极化的精确机制仍不完全清楚，有待进一步研究阐明。
