Lgals3high巨噬细胞通过NF-κB通路协调急性脊髓损伤中的神经炎症和细胞外基质重塑

《Brain Research Bulletin》：Lgals3high Macrophages Orchestrate Neuroinflammation and Extracellular Matrix Remodelling via NF-κB Pathway in Acute Spinal Cord Injury

　　

研究人员通过单细胞转录组学鉴定出Lgals3^high巨噬细胞是一个功能独特的亚群，主导急性脊髓损伤（ASCI）微环境，超越经典M1/M2分类。该巨噬细胞亚群通过galectin-3介导的CCL₂信号和NF-κB通路激活驱动神经炎症和细胞外基质（ECM）重塑，构成核心致病机制。选择性Lgals3抑制剂GB1107在体外和体内模型中促进M1向M2极化，减少炎症浸润和ECM沉积，并降低细胞凋亡。靶向Lgals3^high巨噬细胞提供了一种新型“免疫-基质”治疗策略，可同时调控神经炎症和纤维化瘢痕，以改善脊髓损伤预后。

**论文解读：Lgals3^high巨噬细胞通过NF-κB通路协调急性脊髓损伤中的神经炎症和细胞外基质重塑**

**研究背景与问题**

脊髓损伤（SCI）是一种导致运动、感觉和自主功能严重受损的病理状态，全球发病率约为每百万人23.77例。急性脊髓损伤（ASCI）后发生继发性病理改变，包括脊髓凋亡坏死、轴突变性、脱髓鞘及胶质瘢痕形成，其破坏性常超过原发性损伤。ASCI的急性期（0–3天）涉及即时组织损伤、细胞间趋化诱导、免疫微环境改变及继发性损伤启动。细胞外基质（ECM）是影响继发性损伤的关键因素，减少ECM过度沉积可减少瘢痕形成，促进神经修复。然而，经典M1/M2巨噬细胞分类未能充分阐明巨噬细胞在ECM重塑中的作用。单细胞RNA测序（scRNA-seq）在癌症治疗中已鉴定出多种新型巨噬细胞亚型，但ASCI中ECM重塑和更新的机制仍不清楚。Lgals3基因编码的galectin-3蛋白参与细胞凋亡、先天免疫、细胞黏附和T细胞调节，在SCI后损伤部位浸润的巨噬细胞中高表达，但其在ASCI后的潜在作用尚未完全阐明。

**研究内容与结论**

研究人员首次在ASCI微环境中鉴定出以Lgals3高表达为特征的巨噬细胞亚群（Mac-1），并揭示其通过galectin-3/CCL₂/NF-κB轴驱动神经炎症和ECM重塑的核心致病机制。通过体外和体内实验，选择性Lgals3抑制剂GB1107可阻断该轴，促进M1向M2极化，减轻炎症浸润和ECM沉积，并减少细胞凋亡，为ASCI治疗提供了新型“免疫-基质”双靶向策略。该研究发表在《Brain Research Bulletin》。

**关键技术方法**

研究人员整合了公共单细胞转录组数据集GSE189070（来自8只小鼠SCI样本，涵盖多个损伤后时间点，包括急性期0.5、1、3天，亚急性期7天，慢性期14、60、90天），通过Seurat包进行质控、聚类和细胞类型注释，利用ECM相关基因集（从GeneCards数据库筛选432个基因）进行非负矩阵分解（NMF）聚类，鉴定出4个ECM相关巨噬细胞亚群。采用Monocle进行伪时间轨迹分析，CellChat推断细胞间通讯，SCENIC分析转录因子活性。体外实验使用RAW264.7细胞，以脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）诱导M1极化，用GB1107（7 μM）、siRNA敲低Lgals3、NF-κB抑制剂QNZ（0.1 μM）及TNF-α（10 ng/mL）拯救实验处理。体内实验采用雄性SD大鼠（6–8周龄，体重180–220 g，购自北京维通利华）建立ASCI模型（改良Allen’s weight-drop法，70 kdyn冲击力），分为假手术组、ASCI+溶剂组和ASCI+GB1107组（10 mg/kg/day，尾静脉注射，连续3天），进行组织学（HE、TUNEL）和多重免疫组化（mIHC）检测。

**研究结果**

**3.1 解读ASCI的单细胞图谱**
通过scRNA-seq质控获得49,714个高质量细胞，基于Harmony校正批次效应后，UMAP降维聚类识别出13个细胞簇，并注释为7种主要细胞类型：小胶质细胞、巨噬细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、粒细胞、B细胞和T细胞。

**3.2 描绘ASCI微环境中ECM相关表达模式**
巨噬细胞上调最多ECM相关基因，包括Lgals3、Thbs1、Ccl2、Cd44及溶酶体组织蛋白酶（Ctsd、Ctss、Ctsb、Ctsl），功能富集于胶质细胞迁移、伤口愈合、胶原代谢和趋化性。细胞通讯分析显示巨噬细胞具有最强的细胞间相互作用和自激活能力。细胞比例动态变化表明，巨噬细胞在ASCI后0.5天达到峰值，主要作用于急性期和亚急性期。

**3.3 探索ASCI中ECM主导的巨噬细胞亚型及其功能**
基于ECM基因表达谱和NMF聚类，鉴定出4个巨噬细胞亚群：Mac-1（Lgals3^high，特征基因Lgals3、Vim、Thbs1、Ccl2），在ASCI后迅速增加，0.5天达峰值，主导急性期ECM重塑和炎症反应；Mac-2（Spp1、Apoe、Ctsd高表达），在亚急性期和慢性期持续存在；Mac-3（Ctss高表达），参与抗原呈递；Mac-4（Runx2、Ccnd1高表达），调控细胞增殖分化。伪时间分析显示Mac-1位于分化轨迹末端，Mac-2和Mac-3可向Mac-1动态转变。SCENIC分析显示Mac-1特异性激活转录因子Atf4。Reactome富集分析提示Mac-1与ECM降解、组织、弹性纤维形成及受体酪氨酸激酶信号相关。

**3.4 Mac-1主导的细胞间通讯功能景观**
细胞通讯分析表明，Mac-1在所有细胞类型中具有最高的整体相互作用强度和自相互作用权重，是CCL信号通路（Ccl3-Ccr1、Ccl2-Ccr2等）的主要发送者、接收者、中介者和影响者，同时高表达多种趋化因子配体和受体，确认其作为趋化信号枢纽的角色。

**3.5 GB1107通过抑制Lgals3和调控NF-κB通路调节巨噬细胞极化并促进ASCI修复**
体外实验显示，GB1107（7 μM）处理RAW264.7细胞后，M2标志物Arg1表达显著升高，M1标志物Lgals3、iNOS、Ccl2及NF-κB亚基p65、p-p65水平降低，p65核转位率下降。Western blot和qPCR结果一致，表明GB1107抑制Lgals3可促进M1向M2极化转变，并抑制NF-κB通路。

**3.6 Lgals3/NF-κB/p65/Ccl2轴体外调控巨噬细胞极化**
通过siRNA敲低Lgals3，iNOS、Ccl2及p-p65/p65比例降低，Arg1升高；NF-κB抑制剂QNZ处理产生类似极化转变效果，但不影响Lgals3表达；TNF-α拯救实验恢复NF-κB激活后，逆转了Lgals3敲低诱导的M2极化。证实Lgals3通过NF-κB/p65调控Ccl2，耦合内在M1极化和外在单核细胞招募。

**3.7 通过mIHC验证ASCI标本中的Mac-1表型**
多重免疫组化显示，ASCI组脊髓标本中Lgals3、Ccl2、Cd68、Cd86、p65、Cd206表达显著高于假手术组。Lgals3、Ccl2、p65定位于细胞质/膜周，部分p65核转位；Cd86和Cd68主要分布于损伤中心，Cd206分布于损伤周边。Lgals3⁺Cd68⁺Cd86⁺p65⁺Ccl2⁺巨噬细胞（Mac-1样表型）数量显著多于Cd68⁺Cd206⁺巨噬细胞，确认Mac-1在ASCI损伤中心的富集和NF-κB活化。

**体内验证**：GB1107治疗组大鼠脊髓组织HE染色显示细胞排列更紧密，炎症浸润和ECM重塑减轻；TUNEL染色显示凋亡细胞比例显著降低；Western blot显示Arg1升高，Lgals3、iNOS、Ccl2及p-p65/p65比例降低，证实GB1107在体内促进M1向M2极化并抑制NF-κB通路。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次在ASCI微环境中鉴定出Mac-1亚群，其特征为Lgals3⁺Ccl2⁺，兼具促炎和ECM合成双重功能，是对经典M1/M2分类的重要补充。伪时间分析揭示Mac-1、Mac-2、Mac-3之间存在双向转变潜力，表型可塑性受微环境信号空间梯度动态调控。机制上，Lgals3通过NF-κB/p65作为必需下游效应器，调控Ccl2表达，将内在极化和外在单核细胞招募耦合于同一分子杠杆。GB1107作为高亲和力Lgals3抑制剂，在体外和体内均能阻断该轴，促进M1向M2极化，减轻ECM重塑和炎症，同时保留有益的吞噬功能。但研究存在局限性：对小胶质细胞和星形胶质细胞关注不足；缺乏人类ASCI标本直接验证；ECM沉积相关指标验证有限；Mac-1的起源和表型稳定性需结合谱系追踪和空间转录组学进一步阐明；行为学评估仅限3天，需更长期研究确认功能改善。

**研究结论翻译**：本研究通过单细胞分辨率系统生物学分析，首次识别Lgals3^high巨噬细胞（Mac-1）为ASCI后ECM重塑的核心驱动者，并描绘了Lgals3/NF-κB/p65/Ccl2信号轴，通过这些细胞协调神经炎症级联反应。功能丧失、药物抑制和信号重建实验证实NF-κB/p65是Lgals3的必需下游效应器，Ccl2作为连接内在M1极化和外在单核细胞招募的关键节点。作为高选择性Lgals3抑制剂，GB1107在体外和体内模型中通过破坏该轴，促进M1向M2极化转变，减弱ECM重塑和减少凋亡，从而为ASCI治疗提供了一种新的“免疫-基质”双靶向策略。尽管存在局限性，本研究为未来转化研究和临床应用奠定了基础，为改善ASCI患者治疗带来希望。