整合人源相关新替代方法（NAMs）用于硒纳米颗粒生物医学评价：从上皮屏障转运到神经元效应的关联研究

《Nanotoxicology》：Integrated human-relevant NAMs for biomedical evaluation of selenium nanoparticles linking epithelial barrier translocation to neuronal effects

　　

新替代方法（NAMs）日益需要满足在生成人源相关证据并减少对动物实验依赖的同时，评估纳米材料在生物医学中的安全性与有效性。对于治疗性纳米制剂，单一体外实验往往无法捕捉决定功能表现与潜在不良结局的事件序列，包括与暴露界面相互作用、上皮转运及靶组织响应。研究人员在此提出一种整合人源相关NAMs工作流，用于评价经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或聚山梨酯20（Tween）稳定的硒纳米颗粒（SeNPs）。这些SeNPs作为相关纳米医学案例，因该类体系正被越来越多地设计为具备抗氧化、神经保护及药物递送特性。该工作流组合三种互补体外模型：半气液界面三细胞共培养肺泡屏障、具备连续跨上皮电阻监测的黏液胜任肠屏障，以及分化多巴胺能样SH-SY5Y神经元，代表两种主要治疗给药界面与疾病相关下游神经元靶点。各模型中，SeNPs表现出涂层与细胞类型依赖性细胞毒性，在非细胞毒性剂量下保持屏障完整性，并呈现可测量的基底侧转运。神经元摄取获确认，两种SeNP制剂在有效浓度下减弱L-多巴诱导的氧化应激，且不引发可测促炎细胞因子释放。通过关联两种给药相关上皮屏障模型与疾病相关神经元靶点，本研究展示整合NAMs如何支持纳米医学系统的早期去风险化、制剂优先级排序及更明智的临床前开发。

研究背景方面，工程纳米材料在生物医学中的应用增长，使测试策略需生成人源相关证据并减少动物依赖。新替代方法（NAMs）因能提供比常规单细胞实验更反映人体生理的机制与生物相关信息而重要。治疗性纳米系统孤立体外测试不足，因临床相关行为依赖包含给药界面相互作用、屏障完整性保持、有限炎症负担、跨屏障转运及下游靶组织响应的事件序列。研究人员既往开发PVP或Tween稳定的SeNPs作为L-多巴帕金森病递送系统，SeNPs因高比表面、可功能化及调节氧化应激能力受关注。但制剂开发不足以推进临床前，需理解人源相关生物条件下行为。本研究在《Nanotoxicology》发表，目的是表征两SeNP制剂生物行为并演示互补人源NAMs整合为连贯无动物工作流。

关键技术方法上，研究人员采用PVP-SeNPs与Tween-SeNPs两制剂；构建三细胞肺泡屏障（A549、EA.hy926、THP-1来源巨噬细胞样与树突状样细胞）于半气液界面；构建Caco-2/HT29-MTX/Raji B黏液胜任肠屏障并连续监测跨上皮电阻（TEER）；将SH-SY5Y分化为多巴胺能样神经元（视黄酸与佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯诱导）。表征用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、电泳光散射（ELS）、电感耦合等离子体质谱串联（ICP-MS/MS）测总硒；转运定量用ICP-MS/MS；摄取用共聚焦反射显微镜；细胞毒性用resazurin与MTS；炎症用Luminex multiplex测IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α；氧化应激用Ampliflu/过氧化物酶测H₂O₂及DCFH-DA、DHE、mBCl、Rh123探针。

研究结果部分，3.1节表征与稳定性评价显示TEM下PVP-SeNPs初级粒径83.9±8.0 nm、Tween-SeNPs 52.9±2.7 nm；DLS在超纯水中d_H分别86.6与63.1 nm，细胞培养基中增至132.8与122.9 nm且24 h稳定；ζ电位由水相约?47 mV降至培养基?7.7与?11.7 mV，无蛋白冠直接分析但推断蛋白冠介导空间稳定；1 h与24 h无溶解。3.2节细胞毒性表明两屏障与神经元均剂量依赖存活率下降，肠屏障耐受最强（IC₅₀最高），肺泡A549+巨噬对Tween-SeNPs耐受异常高（116.0 mg Se/L），神经元最敏感且Tween-SeNPs比PVP-SeNPs毒性更大（IC₅₀约半）；L-多巴至100 μM不毒。3.3节转运与摄取中，24 h非毒剂量下肺泡（15 mg Se/L）与肠（10 mg Se/L）基底侧转运率约3%–6%，肺泡略高，PVP-SeNPs稍优于Tween-SeNPs；共聚焦反射确认SH-SY5Y内SeNP相关反射信号（1 mg Se/L），定性非定量定位。3.4节炎症响应中，15 mg Se/L（肺泡）与400 mg Se/L（肠）及神经元1–5 mg Se/L下，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α均无显著升高，LPS阳性对照预期激活。3.5节氧化应激中，肺泡与肠顶侧H₂O₂释放显示L-多巴（50 μM）促氧化，SeNPs单独不增H₂O₂，SeNPs+L-多巴显著降低H₂O₂；神经元中L-多巴升超氧（DHE），SeNPs或SeNPs+L-多巴不升且降低超氧，线粒体膜电位（Rh123）未被破坏。

讨论部分总结，涂层依赖毒性不跨模型一致，归因为界面化学、蛋白冠、内吞与细胞内处理差异而非仅核尺寸；屏障低转运因黏液、巨噬清除、紧密连接及膜孔限制；无炎症伴ROS减弱符合Nrf2–Keap1/GPx轴拮抗NF-κB推论但未直接测通路；短期神经元保护更似直接ROS清除而非硒酶新合成。结论部分翻译：本研究对既往提议为神经退行病L-多巴递送的Tween-SeNPs与PVP-SeNPs进行跨多巴胺能样神经元、肺泡屏障、肠屏障的综合体外评价，两制剂均剂量依赖毒且神经元最敏；有限跨屏障转运与神经元内吞，涂层影响小；无促炎细胞因子；在神经元减弱L-多巴诱导氧化应激并稳线粒体，无炎症伴随；该无动物工作流展示整合NAMs可比较纳米制剂、定给药相关效应水平并关联下游神经元响应，早期减动物并支撑纳米医学理性临床前进展。