《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A bioengineering approach to guide non-integrated stem cell-derived embryo model towards yolk sac development and hematopoiesis
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将干细胞来源的多组织构建体（如非整合胚胎模型）与生物工程技术相结合，为组织工程和药物测试提供了可扩展的工具。研究人员展示了在毫孔内控制启动XEn/EpiCs（一种模拟E5.5阶段胚胎部分特征的部分化学可控小鼠胚胎模型）的器官发生。XEn/EpiCs自发进展发育
将干细胞来源的多组织构建体（如非整合胚胎模型）与生物工程技术相结合，为组织工程和药物测试提供了可扩展的工具。研究人员展示了在毫孔内控制启动XEn/EpiCs（一种模拟E5.5阶段胚胎部分特征的部分化学可控小鼠胚胎模型）的器官发生。XEn/EpiCs自发进展发育出一个充满液体的腔体，类似于包裹着胚胎区室的卵黄囊。在卵黄囊样（YS+）结构中，局部受限的内部区域发生心肌发生，表现出自发收缩，而外部区域则启动血管发生。部分血管化的YS+结构发育出由原始红细胞、内皮细胞和间质细胞组成的血岛。此外，研究人员使用热成型毫孔平台开发了一种连续的单步培养方法，实现了对XEn/EpiCs向器官发生发展的实时跟踪、通路调节和原位可视化。总体而言，研究人员证明了一种缺乏滋养外胚层细胞和外部刺激的多组织血管化胚胎模型，该模型能够进行着床后形态发生，并可在微工程平台中进行调制以用于多种应用。
组织工程与干细胞生物学的融合在构建具有复杂结构的多细胞功能构建体方面取得了关键进展，这对于再生医学、发育研究和疾病建模具有迫切需求。然而，传统的干细胞源类组织结构往往缺乏体内对应组织所具有的形态和功能复杂性。干细胞来源的胚胎模型为解决这些局限性提供了全新途径，但完全整合的胚胎模型结构过于复杂，难以进行高通量培养和高效读出，且可能引发伦理争议。为此，研究人员将目标转向非整合的胚胎样结构，以期在规避部分伦理问题的同时，利用胚胎发育过程中的组织互惠共诱导原理来探究多器官发育。小鼠卵黄囊源自内脏内胚层和胚外中胚层，对胚胎生长至关重要，是原始造血发生的主要部位，并与早期心脏发育密切相关。为了更深入地研究着床后形态发生及心血管与造血生态位的 intricate interplay，相关研究的开展显得尤为必要。
研究人员在此项研究中展示了一种非整合的、化学诱导的小鼠胚胎模型，该模型能够在缺乏滋养外胚层和血清的微工程平台中，自主从着床后形态进展至卵黄囊形成和早期器官发生时期。他们得出结论，该模型不仅能够自发形成包含功能性的、可自发收缩的心肌细胞簇以及血管化的卵黄囊样结构，还能进一步生成含有原始红细胞、内皮细胞和间质细胞的血岛。这项研究的重要意义在于提供了一种可扩展、易操作的活体追踪平台，为临床前药物发育毒性筛选及多组织发育机制研究开辟了新途径。本研究成果已发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
在关键技术方法方面，研究人员主要依托一个基于水凝胶微孔及热成型毫孔的培养平台。实验未采用复杂的细胞饲养层或基质共培养，而是使用单一物种的小鼠胚胎干细胞（包含Gata6报告系统），在特异性诱导因子的短暂作用下形成聚集物，随后在无血清的基础N2B27培养基中进行长达14天的连续培养。研究过程中运用了Bulk RNA测序对各发育形态的细胞类型比例进行计算解卷积分析，并辅以单细胞RNA测序、定量PCR（qPCR）、免疫荧光染色及透射电子显微镜（TEM）对各类细胞标志物及超微结构进行精确定性验证，同时利用DAC荧光扩散实验检测上皮屏障的通透性，并使用DL-肾上腺素测试心肌簇的收缩反应。
研究结果部分的具体发现如下：
在“Characterization of the post-implantation progression of XEn/EpiCs towards organogenesis”（XEn/EpiCs向器官发生的着床后进展特征）部分，研究发现当XEn/EpiCs在无血清培养基中长期培养时，能够自我组织并形成类似卵黄囊的充满液体的囊腔。通过Bulk RNA测序与CIBERSORT分析比对小鼠原肠胚形成期数据，证实了这些YS+结构中富含内脏内胚层、新生中胚层及造血内皮相关的细胞特征，而未形成卵黄囊的结构则更倾向于前脑或神经外胚层命运。这表明卵黄囊的发育对中内胚层的分化具有促进作用。
在“Specification of mesendodermal tissues in day 7 yolk sac-like structures”（第7天卵黄囊样结构中中内胚层组织分化）部分，研究人员通过qPCR检测发现，中胚层标志物Brachyury和内胚层标志物Sox17在培养过程中呈现显著上调，证明了这些结构中存在生殖层分化与持续的内胚层分化过程，这也说明延长培养可以允许早期器官发生所需的多谱系分化。
在“Yolk sac-like structures with contracting cardiomyocyte-like clusters”（具有收缩类心肌细胞簇的卵黄囊样结构）部分，在第10天的YS+结构中，部分区域能够自发产生节律性收缩。通过单细胞转录组分析、TEM观测及免疫组化，证实这些收缩区包含了具有典型心肌超微结构（线粒体和闰盘肌纤维）和心肌特异性蛋白的细胞。功能测试进一步表明，这些具有收缩能力的结构在暴露于DL-肾上腺素后，其收缩频率显著增加，说明其具备类似天然的、对药物刺激有响应的功能性心肌特征。
在“Vascularized yolk sacs”（血管化卵黄囊）部分，研究发现在第10天之后，YS+结构的外周开始形成毛细管样网络。免疫染色显著显示出卵黄囊标志物Apoa4以及血管化标志物VEGFa和CD31的表达模式。更为重要地，通过葡聚糖渗透实验证实该卵黄囊上皮层具有类似于体内膜结构的紧密屏障功能，且该屏障依赖于钙依赖性的细胞间连接，能够特异性阻挡外源分子的自由渗透。
在“Yolk sac XEn/EpiCs as a site for primitive hematopoiesis and blood island formation”及“Characterization of primitive erythropoiesis in YS+ structures”（卵黄囊XEn/EpiCs作为原始造血和血岛形成部位以及原始红细胞生成的特征）部分，研究表明在第14天的培养物中，成功发现了类似于体内血岛的结构。不仅通过TEM直接观察到了原始红细胞、成红细胞及去核红细胞，流式细胞术分析也清晰地从细胞群中鉴定出了红系巨核前体、髓系前体以及早期CD45+的造血细胞群，确凿地证明了该模型能够在体外自主完成原始造血发生并再现血岛的发育过程。
在“Modulation and tracking of in vitro organogenesis using XEn/EpiCs in a customized milliwell platform”（利用定制毫孔平台调制和追踪XEn/EpiCs体外器官发生）部分，研究人员展示了通过在特定发育窗口（96至120小时）施加通路调节剂，能够有效改变其后的器官发生方向：BMP4处理显著促进了空的卵黄囊样结构增多，Chir99021（Wnt激动剂）有效提升了带有自发收缩心肌的YS+结构的比例，而XAV939（Wnt拮抗剂）则促进了血管化结构的形成。实验还确认了该定制的热成型毫孔平台能够显著加速并提高YS+CM+结构的形成效率，并允许对每个微结构进行长期原位追踪。
最后在讨论部分总结，研究人员开发了一种在微孔/毫孔中化学诱导的非整合胚胎模型。该模型在无滋养层信号和外部血清的条件下，成功重现了从着床后形态到早期器官发生的全过程，并在复杂的自组织过程后产生了具有预血管化的卵黄囊结构、自发跳动的心肌区域以及原始血岛。通过借助微工程化平台对关键发育通路进行精确的时空调节，研究人员证明了该模型不仅能自发涌现多组织结构，还具备高度可塑性。该研究不仅为深入理解多组织互惠诱导机制及造血发生基础提供了一个具备极强可控性与可扩展性的生物工程筛选工具，也为未来探索人工构建更复杂且适应于高通量分析的发育与疾病模型奠定了坚实基础。
