基于CD90.2的实用FACS策略从成年小鼠神经获取雪旺细胞富集培养

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：A practical CD90.2-based FACS strategy for obtaining Schwann cell-enriched cultures from adult mouse nerves

　　

从成年小鼠外周神经获得的原代雪旺细胞培养常因成纤维细胞过度生长而受损，限制了其在体外研究中的应用。现有富集策略通常依赖选择性培养条件、长期培养或抗体介导的正选，这可能会改变雪旺细胞生理、触发不必要的信号转导或导致成纤维细胞去除不完全。为解决这些限制，研究人员开发了一种可重复的阴性选择方案，利用荧光激活细胞分选（FACS）分离和富集原代成年小鼠雪旺细胞。通过使用标记物CD90.2（Thy-1.2）特异性靶向污染性成纤维细胞，这些细胞被有效去除，而雪旺细胞群体则不与抗体复合物结合。该方法无需延长体外扩增或使用抗有丝分裂剂，即可快速生成高度富集的雪旺细胞群体。通过避免雪旺细胞上的直接受体-配体相互作用，该方法保留了其原生生理状态和表面表位，支持敏感的下游应用。通过定量PCR、蛋白质印迹和免疫细胞化学验证了成功的雪旺细胞富集，证明了雪旺细胞特异性标记物的富集和极低的成纤维细胞污染。总体而言，该方法能够快速生成高度富集的雪旺细胞群体，同时保留了与成熟雪旺细胞生物学相关的特征。该方案为需要生理代表性成年雪旺细胞进行外周神经系统分子、功能和共培养研究的研究人员提供了一个稳健且实用的工具。

**论文解读：基于CD90.2阴性选择的FACS策略富集成年小鼠雪旺细胞**

**研究背景与问题**
雪旺细胞（Schwann cell）是外周神经系统（PNS）的主要胶质细胞，支持轴突营养、维持髓鞘并协调神经损伤后的复杂细胞反应（Bosch-Queralt et al., 2023）。高质量的原代雪旺细胞培养是研究外周神经病、神经再生及细胞疗法的基础（Morrissey et al., 1991; Hyung et al., 2015; Endo et al., 2022; Negro et al., 2022）。然而，从成年小鼠外周神经获取原代雪旺细胞面临严重的技术挑战：酶解和机械解离后，细胞悬液呈异质性，其中成纤维细胞（fibroblast）因增殖速度快而迅速占据培养优势，尤其在外周神经结缔组织层中含量丰富（Monje, 2023; Metafune et al., 2025）。传统富集方法如抗有丝分裂剂、cAMP升高化合物或“冷喷射”技术，虽能部分抑制成纤维细胞，但常导致机械、热和化学应激，影响雪旺细胞活力与生理状态，且无法完全去除成纤维细胞（Jirsová et al., 1997; Teare et al., 2004; Shen et al., 2012）。近年发展的免疫淘选、磁珠分选和流式细胞术多采用正选策略（如靶向P75神经生长因子受体），但抗体结合可能掩盖表面表位、触发信号转导并改变细胞状态（Elkord et al., 2005; Beliakova-Bethell et al., 2014）。因此，需要一种可避免直接靶向雪旺细胞表面标记物、同时高效去除成纤维细胞的负选策略。

**研究内容与结论**
本研究建立了一种基于CD90.2（Thy-1.2）的FACS阴性选择方案，用于从成年小鼠坐骨神经和臂丛神经中分离高纯度雪旺细胞。通过标记成纤维细胞高表达的CD90.2，去除CD90.2⁺细胞，收集CD90.2^–组分，获得未结合抗体的雪旺细胞。该方法在短期培养（7–10天）后，经单步FACS分选，可稳定获得纯度>97%的雪旺细胞群体（表2）。通过定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（western blot）和免疫细胞化学（ICC）在转录和翻译水平验证了细胞身份：CD90.2^–组分中雪旺细胞标记物（Mpz、P75）表达显著升高，成纤维细胞标记物（Cd90、Pdgfrα）表达极低；CD90.2⁺组分则相反（图3、图4）。该方案避免了直接受体-配体相互作用，保留了雪旺细胞的天然生理状态和表面表位，支持敏感下游分析。论文发表在《Frontiers in Cellular Neuroscience》。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：① 从成年C57BL/6J小鼠（8–12周龄，雌雄兼用）解剖坐骨神经和臂丛神经，经机械撕碎和酶解（胶原酶I/分散酶II）获得单细胞悬液；② 采用PLL（多聚赖氨酸）包被表面进行液滴接种，短期培养7–10天以清除髓鞘碎片并促进细胞恢复；③ 使用FITC偶联抗CD90.2抗体标记细胞，通过BD FACSAria Fusion分选仪（100 μm喷嘴）进行FACS，设置门控排除碎片和双联体，收集CD90.2^–组分；④ 通过qPCR（SYBR Green法）、蛋白质印迹（ECL检测）和免疫细胞化学（荧光显微镜）对分选后群体进行分子和细胞水平验证。

**研究结果**
**4.1 雪旺细胞形态与分选前后纯度**
通过相差显微镜观察，分选前混合培养物包含双极雪旺细胞和多边形成纤维细胞。CD90.2^–组分主要由细长梭形细胞（雪旺细胞形态）组成，CD90.2⁺组分则由扁平多边形细胞（成纤维细胞）组成（图2A）。流式细胞术显示分选前CD90.2^–和CD90.2⁺细胞分别占43.3%和49.3%，分选后目标组分显著富集，交叉污染极低（图2B、C），独立实验纯度>97%（表2）。

**4.2 基因表达分析验证细胞身份**
qPCR检测显示，CD90.2^–组分中雪旺细胞标记物Mpz（髓鞘蛋白零）和P75（神经生长因子受体）表达显著高于CD90.2⁺组分，而成纤维细胞标记物Cd90（CD90）和Pdgfrα（血小板衍生生长因子受体α）在CD90.2⁺组分中表达更高，差异在多个独立重复中一致（图3A）。

**4.3 蛋白质水平验证**
蛋白质印迹分析显示，CD90.2^–组分中雪旺细胞蛋白MPZ和P75水平显著升高，而CD90.2⁺组分中成纤维细胞蛋白CD90.2和PDGFRα水平更高，β-肌动蛋白作为内参（图3B、C）。统计检验（Mann-Whitney检验，Holm-?ídák多重比较校正）确认差异显著（**p<0.01, ***p<0.001）。

**4.4 单细胞水平免疫细胞化学验证**
免疫荧光染色显示，CD90.2^–组分中绝大多数细胞为P75阳性且呈双极形态，CD90.2和PDGFRα信号微弱；CD90.2⁺组分则相反，CD90.2和PDGFRα强阳性，P75弱阳性。定量分析（集成荧光强度）证实两组分间标记物表达差异显著（Kruskal-Wallis检验，*p<0.05, ***p<0.001）（图4）。

**总结与讨论**
本研究开发的CD90.2阴性选择FACS方案克服了传统正选策略的局限性，避免了直接结合雪旺细胞表面受体，保护了其天然生理状态和表面表位。该方法适用于需要高纯度、未受扰动的成年雪旺细胞的下游应用，如配体结合实验、细胞药物筛选、共培养髓鞘化研究等。讨论部分指出，该方案需7–10天预培养，可能引入表型漂移，但此步骤基于成熟培养条件以支持细胞存活，且既往研究显示其可维持雪旺细胞特性（Andersen et al., 2016）。分选过程中的剪切应力可能影响活力，但本研究未观察到显著影响。CD90.2^–组分并非完全由雪旺细胞组成，可能包含少量血管细胞（CD31⁺）和免疫细胞（CD45⁺），但通过短期培养可选择性去除；未来可通过添加额外标记物（如CD31、CD45）进一步纯化。蛋白质分析基于混合样本，无法评估个体间差异。研究结论：优化的CD90.2阴性选择方案提供了一种稳健方法，可获取高纯度原代成熟小鼠雪旺细胞，同时优先保证细胞完整性和原始生理状态，特别适用于需要高分子敏感性和未接触表面受体的应用。