《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Deletion of the calcium-binding protein S100β alters axon initial segment development in the visual cortex
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轴突起始段（axon initial segment, AIS）是精细调节神经元兴奋性的关键结构。在多个感觉系统的发育过程中，AIS发挥重要作用，参与网络细化和兴奋性水平的调整。在视觉皮层中，AIS经历一个显著的可塑性时期，有助于在关键发育阶段（如睁眼和双眼视
轴突起始段（axon initial segment, AIS）是精细调节神经元兴奋性的关键结构。在多个感觉系统的发育过程中，AIS发挥重要作用，参与网络细化和兴奋性水平的调整。在视觉皮层中，AIS经历一个显著的可塑性时期，有助于在关键发育阶段（如睁眼和双眼视觉的建立）调节神经元兴奋性。这一发育过程受到包括胶质细胞在内的多种因素的严格调控。钙结合蛋白S100β主要在星形胶质细胞中表达，此前已被证实参与轴突发育。因此，研究人员提出疑问：S100β是否也可能参与视觉皮层AIS的正常发育？在此，研究人员描述了S100β缺失对AIS发育的影响，并检测了其对神经元兴奋性的作用。
**论文解读：钙结合蛋白S100β缺失对视觉皮层轴突起始段发育的影响**
**研究背景与问题**
轴突起始段（axon initial segment, AIS）是位于大多数兴奋性神经元胞体附近的特化结构，富含离子通道，负责动作电位的起始。AIS的几何结构（尤其是长度）强烈调控神经元兴奋性：较长的AIS通常增强兴奋性，而较短的AIS则降低兴奋性。因此，AIS的结构可塑性成为在不同时间尺度上调节神经元兴奋性的重要机制。在感觉系统（如视觉、听觉、体感系统）的出生后发育过程中，AIS长度经历动态重塑。在小鼠视觉皮层神经元中，AIS长度呈现三阶段成熟过程：从出生后第7天（P7）开始延长，至P10-P15（接近睁眼期）达到峰值，随后在P21左右开始显著缩短，至P28（眼优势可塑性关键期）达到最小值，之后在成年期适度再延长。这种发育性重塑在其他感觉系统中也有报道。然而，调控AIS发育性重塑的分子机制尚不完全清楚。星形胶质细胞在大脑发育中发挥关键作用，是神经环路形成、成熟和精细化的关键调节因子，并已被证明可控制小鼠视觉皮层关键期的关闭。星形胶质细胞释放多种胶质递质，包括S100β——一种多功能的钙结合蛋白，参与神经发育的多个方面，如胶质细胞分化和成熟、神经突生长以及轴突生长调控。S100β的作用具有细胞内和细胞外双重性质：细胞内调节钙信号和稳态，细胞外直接与晚期糖基化终末产物受体（Receptor for Advanced Glycation End-products, RAGE）结合，触发下游级联反应（如ERK1/2和蛋白激酶B通路）。鉴于S100β在轴突发育中的已知作用，研究人员假设S100β的缺失会破坏AIS的正常成熟。此外，由于S100β表达不限于大脑，所用组成型敲除模型无法直接评估细胞类型特异性贡献或与外周器官的相互作用。
**研究内容**
研究人员利用免疫组织化学方法，以锚定蛋白Ankyrin-G（Ank-G）作为AIS标记物，比较了野生型（WT）和S100β敲除（S100β-KO）小鼠视觉皮层第V层锥体神经元（L5PNs）在发育过程中（P7、P15、P21、P28）的AIS长度。同时，采用全细胞膜片钳记录评估神经元兴奋性变化。
**主要技术方法**
1. 免疫组织化学与共聚焦显微镜：使用抗Ank-G抗体标记AIS，对WT和S100β-KO小鼠（C57BL/6J和B6Brd背景）的视觉皮层冠状切片（100 μm）进行染色，采用Zeiss LSM-900共聚焦Airyscan显微镜成像，使用ImageJ和neurite tracer插件进行盲法AIS长度测量（仅纳入单个光学平面内的AIS）。
2. 全细胞膜片钳记录：制备WT和S100β-KO小鼠（P7、P15、P21、P28）的视觉皮层离体切片（350 μm），在突触阻断剂（APV、CNQX、Gabazine）存在下，记录L5PNs的输入-输出（I/O）曲线（0-140 pA，Δ=10 pA），并分析动作电位半宽、峰值、阈值、基强度（rheobase）和输入电阻等电生理参数。
**研究结果**
**结果1：S100β缺失破坏视觉皮层轴突起始段的正常发育**
通过免疫组织化学分析，研究人员在WT小鼠中观察到AIS长度的两阶段发育模式：从P7（28.80 μm）到P15（33.72 μm）的初始延长阶段，随后是从P15到P21（29.67 μm）和P28（24.82 μm）的渐进性显著缩短阶段。相比之下，S100β-KO小鼠在所有检测时间点均表现出AIS长度的连续渐进性缩短：P7（30.51 μm）、P15（27.07 μm）、P21（26.15 μm）、P28（24.92 μm），未见初始延长阶段。在WT小鼠中，AIS长度从P7到P15增加17.1%，随后从P15到P28减少13.57%；而S100β-KO小鼠从P7到P28呈现不间断的18.32%减少。此外，在P7、P15和P21，WT与S100β-KO小鼠的AIS长度存在显著差异（P7: P=0.002; P15和P21: P<0.0001），但在P28无差异（n.s.）。这些结果表明，S100β的缺失破坏了视觉皮层中AIS的正常发育。
**结果2：S100β缺失导致神经元兴奋性降低**
为探究AIS长度差异是否与神经元兴奋性改变相关，研究人员进行了电生理记录。在WT小鼠中，尽管AIS长度从P7到P15增加、之后降低，但I/O曲线显示兴奋性从P7开始显著增加，差异在P21和P28显现（P7 vs. P21和P28: P<0.0001），表明AIS长度变化与兴奋性之间不完全对应。在S100β-KO小鼠中，仅P28与P7、P15相比兴奋性显著增加（P<0.0001）。比较I/O曲线，S100β-KO小鼠整体兴奋性低于WT小鼠，在P7和P21差异显著（P7: P=0.0003; P21: P<0.0001），而在P15和P28差异不显著。在P21，S100β-KO小鼠的基强度显著增加（P<0.01），动作电位半宽显著增加（P<0.05），输入电阻显著降低（P<0.01）；在P7，仅基强度显著降低（P=0.03）。这些结果表明，S100β缺失降低了L5PNs的内在兴奋性，尤其在P21。
**讨论与结论**
**讨论部分总结**
既往研究表明，AIS结构在视觉、听觉和体感系统发育中高度动态，且感觉剥夺会破坏其正常发育。本研究显示，S100β缺失改变了视觉皮层第V层AIS的发育，并在关键成熟阶段降低了锥体神经元的内在兴奋性。
- **S100β对AIS发育性重塑的贡献**：WT小鼠在P7、P15（AIS最大长度，接近睁眼P13-14）、P21（AIS显著缩短，与眼优势关键期CP onset一致）和P28（AIS最短，CP峰值）呈现典型模式。S100β-KO小鼠AIS发育性重塑较弱：P15至P28的长度变化小于WT，提示这一发育窗口期适应性调整能力下降；P7至P15未见AIS增长，导致神经元在睁眼后和CP onset时可能处于相对不成熟状态（类似暗饲养后的功能不成熟）。至P28无差异，暗示S100β缺陷小鼠视觉系统最终通过未知补偿机制趋近WT状态。在睁眼（P13-14）至CP onset（P21）的预关键期，视觉回路的部分成熟独立于视觉经验，而CP期间视觉输入对维持回路组织至关重要。本研究观察更符合预关键期，S100β可能参与调控AIS重塑的内在程序化机制。此外，S100β水平异常（转基因过表达、基因缺失或药理学阻断）会损害长时程增强（LTP）诱导，支持该胶质蛋白参与需要精确神经元时序的活动依赖性可塑性机制。星形胶质细胞还通过释放腺苷和谷氨酸、connexin-30介导的信号等调节突触可塑性。因此，星形胶质细胞来源的S100β可能参与CP onset机制。但本研究无法区分S100β的细胞内和细胞外效应。
- **S100β缺失降低L5PNs内在兴奋性**：除AIS结构改变外，S100β-KO小鼠在P21表现出显著降低的内在兴奋性，同时AIS较短，与既往研究一致（AIS缩短与兴奋性降低相关）。S100β蛋白的一个重要功能是通过降低细胞外钙调节内在兴奋性和放电模式，因此其缺失可能导致兴奋性改变。然而，在P7，WT小鼠AIS稍短但兴奋性更高；在P15，尽管AIS长度差异显著，兴奋性无差异，表明AIS长度并非唯一决定因素，输入电阻、离子通道组成和分布等其他因素可能起作用。钠通道NaV1.2和NaV1.6的差异比例可能部分解释这一分离。另一种解释是S100β-KO小鼠可能加速发育轨迹，在P7左右达到更早成熟。研究局限性包括：组成型敲除模型无法确定S100β释放的细胞来源，且WT和S100β-KO小鼠遗传背景不同（B6J vs. B6Brd），不能排除品系特异性效应。
**结论部分翻译**
多项功能已被归因于钙结合蛋白S100β，但其全部作用尚未完全揭示。我们的结果表明，S100β似乎并非视觉CP峰值时AIS最终状态所必需，而是对AIS成熟的动态过程以及预关键期和CP onset期间对感觉活动的早期适应至关重要。更好地理解控制视觉CP开放和关闭的机制，最终可能有助于识别在成年大脑中重新激活结构可塑性的方法，对脑损伤和神经发育障碍具有潜在治疗意义。
（论文发表在《Frontiers in Cellular Neuroscience》）
