《Histochemistry and Cell Biology》：A high-throughput, plate reader-based method for the assessment of oxidative stress in suspension mammalian cells using CellROX Green
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细胞内活性氧（ROS）水平的测量为细胞健康和病理生理学提供了关键见解。研究人员提出了一种半定量、基于微孔板读数仪（plate reader）的方案，使用CellROX Green，可用于实时测量存活悬浮哺乳动物细胞的一般ROS水平。以甲萘醌（menadione
细胞内活性氧（ROS）水平的测量为细胞健康和病理生理学提供了关键见解。研究人员提出了一种半定量、基于微孔板读数仪（plate reader）的方案，使用CellROX Green，可用于实时测量存活悬浮哺乳动物细胞的一般ROS水平。以甲萘醌（menadione）作为氧化应激诱导剂，每孔100,000个细胞的浓度、10 μM的CellROX Green浓度以及1小时的CellROX Green孵育时间被证明能够最准确地测量存活人单核细胞白血病（THP-1）细胞内的ROS水平。与使用其他一般ROS敏感荧光探针的微孔板读数仪方案不同，该微孔板读数仪方案在测量荧光前省去了洗涤未结合探针的步骤，使其更适合悬浮细胞。使用所提出的方案，可在1分钟内测量多达96个样本的荧光，使其非常适合用于需要测量中等至较大氧化应激水平差异的快速筛选应用。
**论文解读：基于CellROX Green的微孔板读数仪高通量方法用于悬浮哺乳动物细胞氧化应激评估**
**研究背景与问题**
活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是含有未配对电子的高反应性含氧分子，在正常条件下参与细胞分化、代谢和生长调控。然而，在应激条件下，ROS产生显著增加，可能超过细胞的内源性抗氧化机制，导致氧化应激，进而引发细胞信号改变、细胞组分降解、细胞衰老甚至死亡。因此，准确测量细胞内ROS水平对理解细胞健康和病理生理学至关重要。
现有ROS检测方法面临挑战：ROS反应性高、半衰期短、丰度低。荧光探针（如DCFDA和DHR123）虽广泛用于测量一般ROS水平，但存在信号自放大、光敏性、需洗涤步骤（导致悬浮细胞损失）等缺陷。CellROX Green是一种新型细胞渗透性荧光探针，经ROS氧化后结合DNA发出强荧光，具有一步反应、稳定性好、可固定等优点，但此前仅用于荧光显微镜和流式细胞术，缺乏基于微孔板读数仪（plate reader）的直接检测活细胞ROS的方案。
**研究目的与意义**
本研究旨在开发一种半定量、基于微孔板读数仪的高通量方法，使用CellROX Green实时测量存活悬浮哺乳动物细胞的ROS水平。该方法可快速筛选（1分钟内测量96个样本）中等至较大氧化应激差异，适用于抗癌药物、抗炎药物筛选及冷冻保存后ROS评估等领域。论文发表在《Histochemistry and Cell Biology》。
**主要关键技术方法**
研究人员以人单核细胞白血病（THP-1）细胞（购自ATCC）为模型悬浮细胞系，以甲萘醌（menadione）诱导氧化应激。优化参数包括：细胞浓度（10,000、40,000、100,000细胞/孔）、CellROX Green浓度（5、10、20 μM）、孵育时间（0.5、1、2小时）、缓冲液/培养基类型（PBS、RPMI、DMEM，含或不含FBS）、激发/发射波长组合（475/525 nm、485/520 nm、500/525 nm、507/525 nm）及发射带宽（5 nm、12 nm）。使用Varioskan Lux微孔板读数仪采集底部荧光，并以流式细胞术（BD Accuri C6）作为基准验证。此外，在人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞，由RMIT大学合作者提供）中验证方法适用性。
**研究结果**
**1. 确定最佳细胞和CellROX Green浓度**
通过比较不同细胞浓度（10,000、40,000、100,000细胞/孔）和CellROX Green浓度（5、10、20 μM）下的荧光强度，发现100,000细胞/孔与10 μM CellROX Green组合可提供最准确测量。未染色样本和细胞-free样本均无显著荧光，表明未结合探针和残留甲萘醌不贡献背景荧光，无需洗涤步骤，优于DCFDA和DHR123方案。
**2. 确定CellROX Green孵育时间**
测试0.5、1、2小时孵育，发现1小时孵育在避免自氧化、探针毒性和信号饱和的同时，提供足够荧光信号（525 nm处峰值），被选为最佳时间。
**3. 测量不同缓冲液和培养基的荧光**
在PBS或培养基（RPMI、DMEM）中，添加胎牛血清（FBS）对荧光影响不一致且增大变异，建议使用无FBS的PBS进行方案优化。
**4. 优化荧光激发和发射条件**
测试多种激发/发射组合（475/525、485/520、500/525、507/525 nm）及发射带宽（5、12 nm），所有组合均显示相似标准化荧光，表明任何组合均可用于Varioskan Lux，但建议先获取500–600 nm发射光谱以评估样本质量。
**5. 确定离心步骤的重要性**
比较离心前后荧光，离心步骤不显著影响测量值，但可减少复孔间变异，建议采用。
**6. 与流式细胞术比较**
流式细胞术灵敏度更高，但微孔板方案在10 μM和100 μM甲萘醌处理下获得与流式细胞术一致的趋势（约3倍荧光增加），且速度更快（1分钟96样本 vs. 8小时96样本）、体积更小（70 μL vs. 1.5 mL）、设备更普及，适合快速筛选。
**7. 在悬浮HaCaT细胞中验证**
将方案应用于悬浮HaCaT细胞，成功检测到不同浓度甲萘醌诱导的ROS变化，表明该方案可推广至其他细胞系，但需细胞特异性验证。
**讨论与结论**
本方案首次实现了CellROX Green与微孔板读数仪结合，直接测量完整存活悬浮哺乳动物细胞的ROS水平。与DCFDA和DHR123方案相比，无需洗涤未结合探针，避免了细胞损失，更适合悬浮细胞。虽灵敏度低于流式细胞术，但可检测中等至较大氧化应激差异，适用于高通量筛选。方案局限性在于CellROX Green化学结构未公开，可能影响对潜在伪影的理解。尽管如此，该方法为快速、可扩展、用户友好的氧化应激检测提供了可靠替代方案，有望应用于其他悬浮哺乳动物细胞类型。
**结论翻译**
细胞内ROS的准确测量为细胞健康提供了关键见解。然而，由于ROS的低丰度、高反应性和短半衰期，基于微孔板读数仪的哺乳动物细胞ROS测量方法稀缺。据研究人员所知，研究团队首次开发了一种半定量、基于微孔板读数仪且使用CellROX Green的方案，可用于测量存活THP-1细胞（一种悬浮哺乳动物细胞模型）的细胞内ROS水平。以甲萘醌作为氧化应激诱导剂，每孔100,000个细胞的浓度、10 μM的CellROX Green浓度、1小时的CellROX Green孵育时间以及在获取荧光前加入离心步骤，被证明能最准确测量THP-1细胞内的ROS水平。利用Varioskan Lux微孔板读数仪，在特定条件范围内，激发波长475–507 nm、发射波长520–532 nm可提供代表THP-1细胞内一般ROS水平的准确数据。该方案也可适用于贴壁哺乳动物细胞，但需更大孔板以支持所需细胞浓度。如预期，微孔板方案灵敏度低于流式细胞仪，但两种方法趋势一致，证实该方案可作为快速、简单的方法检测悬浮细胞中中等至高水平ROS及氧化应激变化。若ROS水平预期较低，则可能需要更灵敏的流式细胞术。与DCFDA和DHR123探针不同，CellROX Green的化学结构未知，因此无法全面了解其特性及对测量准确性的影响。尽管如此，本方案可视为DCFDA和DHR123微孔板方案的可信赖替代方案。本方案的独特之处在于省去了测量荧光前的洗涤步骤，未结合CellROX Green不显著贡献背景荧光，从而最小化细胞损失，使其比现有DCFDA和DHR123方案更适合悬浮细胞。与其他已发表的CellROX Green方案不同，本方案能提供完整存活THP-1细胞的一般ROS水平信息，促进ROS的实时测量。此外，使用台式微孔板读数仪替代荧光显微镜或流式细胞仪，提高了CellROX Green的可及性。最终，该方案提供了一种快速、可扩展、用户友好的方法，用于识别悬浮THP-1细胞中中等至较大氧化应激差异，使其非常适合筛选应用，并具有在其他悬浮哺乳动物细胞类型中应用的潜力。
