小鼠感染波瓦桑病毒后病毒神经侵袭、血脑屏障完整性和神经炎症的特征分析

《Frontiers in Immunology》：Characterization of virus neuroinvasion, blood-brain barrier integrity and neuroinflammation following Powassan virus infection in mice

　　

波瓦桑病毒（POWV）是一种由硬蜱属（Ixodes）蜱种传播的蜱传正黄病毒（Orthoflavivirus）。POWV导致约10-30%的神经系统病例发生致命性脑炎，并在约50%的幸存者中引起持久的神经后遗症。POWV进入中枢神经系统（CNS）是决定临床结局的重要事件。在本研究中，研究人员评估了POWV感染C57BL/6J（WT）小鼠后的病毒复制动力学、神经病理学以及宿主免疫反应。数据显示，通过所有接种途径（包括静脉、腹腔、颅内和皮下）感染POWV均导致严重的神经侵袭性疾病。研究人员表明，POWV在WT小鼠中有效复制，其复制和播散导致外周期和嗜神经期。病毒神经侵袭与严重的神经病理学改变以及血脑屏障（BBB）通透性增强相关。接下来，研究人员使用转录组学比较了POWV感染小鼠急性期和晚期大脑中效应通路的诱导情况。在所有检查的时间点，研究人员发现了多个失调基因，包括与干扰素（IFN）信号、神经炎症和细胞死亡信号相关的基因。研究人员检测到POWV感染大脑中参与神经炎症的标志物蛋白水平显著升高。免疫荧光分析进一步验证了转录组学发现，并显示POWV感染大脑中小胶质细胞（IBA1）和星形胶质细胞（GFAP）的活化增加、外周免疫细胞（CD45）的浸润以及神经元细胞死亡（TUNEL）升高。caspase-3和p16蛋白表达的增加进一步表明凋亡和衰老相关通路的激活。有趣的是，研究人员在存活过急性POWV脑炎期的小鼠中检测到病毒RNA，并发现神经炎症持续存在的证据，尽管水平较低。总体而言，本研究全面了解了POWV感染小鼠急性期和晚期发生的致病事件。

波瓦桑病毒（POWV）是一种由硬蜱属（Ixodes）蜱种传播的蜱传正黄病毒（Orthoflavivirus），其感染可导致人类严重脑炎，致死率高达10-30%，约50%幸存者遗留长期神经后遗症。目前，POWV脑炎的致病机制尚不完全清楚，尤其是病毒神经侵袭、血脑屏障（BBB）功能障碍、中枢神经系统（CNS）免疫反应及长期疾病进展的调控机制。为深入理解这些病理事件，研究人员在C57BL/6J小鼠模型中开展了系统性研究。该研究通过多种接种途径评估病毒复制动力学、神经病理学、BBB完整性及宿主免疫反应，发现所有途径的外周感染均导致严重神经侵袭性疾病，且皮下感染呈现剂量依赖性死亡率。病毒在脑内高效复制，并与BBB通透性增强相伴随。转录组学分析揭示了急性期和晚期大脑中干扰素（IFN）信号、神经炎症和细胞死亡通路的显著失调，免疫荧光进一步证实了小胶质细胞（IBA1）和星形胶质细胞（GFAP）活化、外周免疫细胞（CD45）浸润、神经元凋亡（TUNEL）及衰老相关蛋白caspase-3和p16表达升高。值得注意的是，存活过急性脑炎期的小鼠仍可检测到病毒RNA和持续的低水平神经炎症。该研究发表于《Frontiers in Immunology》，为理解POWV感染的致病事件提供了全面视角。

关键技术方法：研究使用6周龄雌雄C57BL/6J小鼠，通过皮下（SC）、静脉（IV）、腹腔（IP）和颅内（IC）途径接种POWV LB株（1,000 PFU或不同剂量）。采用空斑实验测定血清和脑组织中的病毒滴度；伊文思蓝染料排除实验评估BBB通透性；对脑组织进行全转录组测序（RNA-seq）并结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析差异表达基因（DEGs）；RT-qPCR验证关键基因表达；多重免疫分析（Luminex）检测细胞因子/趋化因子蛋白水平；免疫荧光染色检测dsRNA、NeuN、IBA1、GFAP、CD45、cleaved-caspase-3、p16及TUNEL标记。

研究结果：

2.1 C57BL/6J小鼠中POWV感染的特征：通过比较不同接种途径，发现IC、IV、IP途径感染小鼠在5-10天内全部死亡，SC途径感染小鼠中30%存活至21天，且死亡率呈剂量依赖性。病毒滴度在血清中于2天达高峰，6天下降；脑内滴度于3天可检测，6-8天达峰值，21天仍可检测到低水平病毒RNA和感染性病毒。免疫荧光证实病毒在脑皮质和小脑的神经元中复制（dsRNA与NeuN共定位）。

2.2 POWV神经侵袭及对神经病理学和BBB通透性的影响：组织病理学显示POWV感染小鼠脑内出现血管周围袖套、嗜酸性神经元变性和浦肯野细胞丢失，尤以皮质和丘脑显著。伊文思蓝染料实验表明，BBB通透性在感染后3天开始增强，6天显著增加，提示早期BBB破坏与病毒神经侵袭相关。

2.3 POWV感染诱导脑内基因失调和持续转录变化：RNA-seq分析显示，感染后3、6、8、21天分别有135、998、1303和436个基因上调，5、55、172和115个基因下调。IPA通路分析揭示，感染早期（3天）激活抗病毒反应和小胶质细胞活化，6-8天显著激活趋化、炎症反应和神经系统肿瘤相关通路，部分通路持续至21天。神经元受体信号（如5-羟色胺、阿片受体）在6-8天上调，21天下调。

2.4 POWV感染脑内干扰素、趋化因子/细胞因子和神经元细胞死亡通路的强烈激活：所有时间点均观察到IFN信号通路和干扰素刺激基因（ISG）如、Isg15、Usp18等显著上调。趋化因子基因（Cxcl9、Cxcl10、Ccl2、Ccl5等）和细胞因子基因（Il6、Il12b、Tnf等）在6-8天高度上调，21天水平降低但持续存在。细胞死亡通路相关基因（死亡受体、坏死性凋亡、焦亡）在6-8天显著富集，包括Gsdmd、Casp1、Casp4、Casp8等。

2.5 通过qRT-PCR和多重细胞因子/趋化因子分析验证差异基因表达：RT-qPCR验证了Ccl2、Il6、Casp7、Casp8、Casp4和Gsdmd基因的显著上调。多重免疫分析显示，在3天时仅G-CSF、IL-6和CXCL10轻度升高，6-8天时IFNγ、IL-1α、IL-6、CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10等大量促炎介质显著升高，与RNA-seq数据一致。

2.6 POWV感染诱导脑内胶质细胞活化、白细胞浸润和细胞死亡：免疫荧光显示POWV感染脑内IBA1（小胶质细胞）和GFAP（星形胶质细胞）表达显著增加，CD45阳性外周免疫细胞浸润明显。TUNEL染色表明凋亡细胞广泛分布，cleaved-caspase-3表达升高，p16表达增加提示细胞衰老通路激活。

讨论与结论：讨论部分指出，POWV感染导致BBB早期破坏，其时间点与病毒血症和神经侵袭一致，这是首次实验证明POWV诱导BBB功能障碍。全脑转录组学显示IFN主导的免疫反应持续存在，并与病毒滴度和BBB破坏时间点吻合。炎症介质可能激活下游神经元细胞死亡通路和胶质细胞活化，加重神经炎症。免疫荧光验证了小胶质细胞和星形胶质细胞活化、免疫细胞浸润以及凋亡和衰老相关通路。结论：总之，研究结果表明，通过所有途径的外周POWV感染均导致C57BL/6J小鼠出现严重的神经侵袭性疾病。研究人员表明，POWV感染导致病毒血症快速出现，随后发生神经侵袭并在脑中持续存在。数据进一步证明，POWV在感染后早期进入脑实质，同时伴有BBB通透性破坏。此外，脑转录组学提供了POWV感染小鼠急性期和晚期基因失调的额外信息。