基于衍生化的LC-MS方法的开发与验证用于血清中犬尿氨酸通路代谢物的定量及在癌症患者中的应用

《Journal of Chromatography A》：Development and validation of an LC–MS method based on derivatization for quantification of kynurenine pathway metabolites in serum and application in cancer patients

　　

用于血清中犬尿氨酸通路代谢物定量的LC-MS方法。犬尿氨酸通路代谢物以酯衍生物形式测定。实现了吡啶甲酸（picolinic acid）和喹啉酸（quinolinic acid）的满意分离。该方法能够在生理水平上定量犬尿氨酸通路代谢物。该验证方法成功应用于癌症患者的血清样本。

犬尿氨酸通路（Kynurenine Pathway, KP）是色氨酸（Tryptophan, TRP）的主要代谢途径，其代谢产物如犬尿氨酸（Kynurenine, KYN）、3-羟基犬尿氨酸（3-Hydroxykynurenine, 3HKYN）、犬尿喹啉酸（Kynurenic Acid, KYNA）、喹啉酸（Quinolinic Acid, QA）、吡啶甲酸（Picolinic Acid, PIC）、烟酸（Nicotinic Acid, NA）和黄尿酸（Xanthurenic Acid, XA）在多种疾病（包括癌症）中发挥关键作用。然而，同时定量血清中所有KP代谢物面临分析挑战：下游代谢物（如QA、PIC、NA）因极性高、色谱保留差、电离效率低及基质效应强而难以检测；现有方法多未覆盖全部代谢物，且缺乏对PIC和NA异构体的有效分离。为此，研究人员旨在开发一种基于丁酯衍生化的液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法，实现人血清中七种KP代谢物的同步定量，并验证其在胃癌（Gastric Cancer, GC）和胰腺癌（Pancreatic Cancer, PC）患者中的临床应用价值。该研究发表于《Journal of Chromatography A》。

研究人员采用的关键技术方法包括：（1）丁酯衍生化：利用正丁醇/乙酰氯（9:1, v/v）在57°C下将KP代谢物中的羧基转化为丁酯，以增加疏水性和电离效率，改善色谱保留和分离。（2）固相萃取（SPE）：使用CHROMABOND? HR-X反相柱进行样品纯化，优化洗涤和洗脱条件（以甲醇/乙腈（50:50, v/v）及乙腈洗脱）。（3）LC-MS分析：在XTerra MC C18反相柱上以0.1%乙酸水溶液和甲醇为流动相梯度洗脱，质谱采用正离子模式下的选择离子监测（Selected Ion Monitoring, SIM）模式。（4）内标校正：使用3-硝基-L-酪氨酸（3-Nitro-L-tyrosine, 3NT）作为单一内标，补偿样品制备和基质效应。样本队列来源于波兰卢布林地区肿瘤中心（胃癌患者n=10）和华沙国家医疗研究所（胰腺癌患者n=9），健康对照（n=10）来自卢布林地区血液中心。

研究结果如下：

**3.1 衍生化步骤及其他分析条件的论证**：通过丁酯衍生化，KP代谢物的保留时间显著延长，尤其是3HKYN、QA和PIC的色谱行为得到改善；PIC和NA的异构体因酯基位置不同而实现分离；衍生化提高了检测灵敏度（如QA在未衍生时信号几乎不可检测），并改变了洗脱顺序（从QA<3HKYN
**3.2 LC-MS条件优化**：优化了质谱参数（如碎片电压60-100 V、毛细管电压3000 V、干燥气温度350°C、干燥气流速11 L/min、雾化器压力50 psi）和流动相组成（选择0.1%乙酸水溶液和甲醇），实现了最佳检测信号。

**3.3 样品制备步骤优化**：比较了两种血清纯化策略，最终选择先以三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白，上清液蒸干后衍生化，再经SPE纯化（Chromabond? HR-X柱）。优化了洗涤溶剂（含5%甲醇和0.1%乙酸的水溶液）和洗脱溶剂（甲醇/乙腈（50:50, v/v）后加0.5 mL乙腈冲洗），获得高回收率。

**3.4 方法验证**：线性范围广（R2>0.99），检测限（LOD）和定量下限（LLOQ）在低纳摩尔范围（如KYN的LLOQ为24.26 nM）。精密度（变异系数CV<15%）、准确度（90-110%）、回收率（>70%）均符合要求。基质效应（Matrix Effect, ME）评估显示：PIC和3HKYN表现为中等信号增强（约150%），KYNA表现为中等信号抑制（约70%），3NT基质效应可忽略（约102%）。稳定性试验表明，分析物在自动进样器（24小时）和冻融循环中高浓度稳定，低浓度略有损失（15-20%）。

**3.5 临床血清样本应用**：成功定量了健康对照、GC和PC患者血清中KP代谢物浓度。发现GC患者血清中KYNA水平显著低于健康对照（p=0.026）和PC患者（p=0.018），而PC患者与健康对照无显著差异。其他代谢物（KYN、3HKYN、XA、PIC、QA、NA）在组间无统计学显著差异。

总结讨论部分：研究人员指出，丁酯衍生化策略有效解决了KP代谢物分析中的色谱保留差、电离效率低和异构体分离困难等关键问题，与现有方法相比，本方法首次将衍生化应用于血清并扩展至七种代谢物，包括通常被忽略的PIC和NA。方法验证数据表明其可靠性，但部分代谢物（如XA、NA、PIC、QA）在部分样本中低于检测限，提示仍需进一步优化灵敏度。研究结论部分翻译如下：本研究开发并验证了一种LC-MS方法，用于同时定量人血清中七种犬尿氨酸通路代谢物。为解决结构相似且极性色氨酸代谢物测定的分析挑战，在血清制备阶段引入了基于酯化的衍生化策略。该方法增加了分析物分子量，降低了基质背景噪声，改善了分离和保留，并允许纳入吡啶甲酸和烟酸等通常被忽略的代谢物。此外，快速洗脱的化合物（3-羟基犬尿氨酸、喹啉酸、吡啶甲酸、烟酸和犬尿氨酸）表现出更好的分离。该方法对定量人血清中内源性KP代谢物具有足够的灵敏度和选择性，为复杂生物基质中靶向代谢物分析提供了稳健的分析平台。