《Autism Research》：Interaction of the Gut Microbiota and the Enteric Nervous System: Implications in Gastrointestinal Disorders Associated With Autism Spectrum Disorder
自闭症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍，其特征为社交互动受损、兴趣受限和重复行为。除了这些核心行为症状外，胃肠道（GI）疾病也频繁被报告，范围从严重便秘到腹泻。ASD与肠道功能障碍之间的联系还得到肠道微生物群组成和细菌衍生代谢物变化的进一步支持。作为消化道的固有神经系统，肠神经系统（ENS）通过对多种肠道功能（包括运动）施加神经控制，在肠道生理学中发挥核心作用。位于肠道微生物群与肠道功能之间的界面，ENS可能在ASD相关的GI症状中起关键作用，正如在多个小鼠模型中所证明的那样。本综述旨在总结ASD中肠道微生物群和ENS的相互关联改变，特别关注在患者和动物模型中发生改变的、可能影响ENS发育和功能的微生物群衍生介质。通过强调这些相互作用，本综述旨在为ASD的消化系统病理生理学提供新见解，这也可能有助于解释行为症状的严重程度。
1 引言
自闭症谱系障碍（ASD）是一种在儿童早期出现的神经发育障碍。根据《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-V），ASD的特征是社交互动和沟通改变，伴随重复行为和兴趣受限。ASD的全球患病率持续上升，在一般人群中估计约为1%。ASD的病因涉及遗传和环境因素。在遗传因素方面，已有超过100个基因被证实与ASD风险相关。这些基因大多编码突触支架蛋白、受体、细胞粘附分子，或参与染色质重塑、转录、蛋白质合成与降解以及肌动蛋白细胞骨架动力学。此外，在子宫内和儿童期暴露于环境因素，如高龄父母、代谢状况、甲状腺激素失衡、高血压以及暴露于不同有毒物质、污染物、杀虫剂以及细菌或病毒感染，也与ASD发病率增加有关。尽管缺乏直接证据，但来自人类和动物研究的汇聚发现将ASD与脑连接性和突触功能缺陷联系起来。
ASD还与广泛的共病相关，包括神经系统疾病如癫痫、睡眠障碍、焦虑和强迫症。此外，与神经典型人群相比，ASD患者胃肠道（GI）疾病的患病率更高。据估计，50%–70%的ASD患者经历GI症状，包括便秘、腹泻、腹胀和腹痛。有趣的是，多项研究报告了GI紊乱严重程度与行为症状之间的相关性，提示肠道和脑功能障碍存在共同的潜在机制。ASD与肠道功能障碍之间的联系还得到肠道微生物群失调和细菌衍生代谢物改变的证据支持。ASD中GI障碍的另一个因素是肠神经系统（ENS）。作为消化道的固有组成部分，ENS通过施加神经控制肠道通透性和运动，在肠道生理学中发挥关键作用。位于肠道微生物群与肠道功能之间的界面，ENS可能是ASD相关GI症状的关键参与者，正如在几个ASD小鼠模型中所证明的。此外，ENS可能通过迷走神经代表通往大脑的门户，迷走神经分别通过80%和20%的传入和传出纤维介导肠道/ENS与脑干之间的双向通信。传入纤维感知肠道管腔内容物并将信号传递至大脑，而传出纤维通过与肠神经元直接相互作用控制肠道运动和分泌功能。有趣的是，在ASD儿童中报告了迷走神经活动减弱，这可能损害ENS与大脑之间的通信，从而潜在地导致胃肠道和行为障碍。此外，ENS可能通过内脏传出神经元与交感神经系统的连接影响其他身体系统。由于一些ASD个体中报告了交感神经通路改变，考虑ENS在这些紊乱中的潜在作用非常重要。
最近的综述描述了在ASD小鼠模型中建模的ASD相关遗传因素对ENS结构和功能的影响。然而，仍需要一项全面的分析，将ENS与肠道微生物群产生的细菌代谢物（这些代谢物在自闭症中水平改变）联系起来，以更好地理解肠道微生物群、ENS与自闭症相关胃肠道疾病之间的潜在相互作用。
为了进行这项研究，研究人员基于在PubMed和Web of Science中进行的有针对性的文献检索，以识别检查ASD、肠道微生物群和肠神经系统之间关系的研究。检索词包括“autism spectrum disorder”、“autism”、“gut microbiota”、“microbiome”、“bacterial metabolites”、“enteric nervous system”、“enteric neurons”、“enteric glial cell”、“gut–brain axis”和“gastrointestinal disorders”的组合。优先考虑以英文发表的同行评审文章，重点关注提供机制见解的最新研究和开创性论文。考虑了临床和临床前研究（包括动物模型），以获取关于ENS在微生物群改变背景下的发育和功能的互补视角。根据研究与微生物组成、微生物群衍生代谢物和ENS调节之间相互作用的相关性选择研究，同时努力纳入既支持又挑战当前假设的发现。
通过这篇文献分析，本综述旨在综合关于肠道微生物群和ENS相互关联改变的最新知识，特别关注在患者和动物模型中发生改变的、可能影响ENS发育和功能的微生物群衍生介质。在绝大多数研究中，ENS与ASD之间的联系主要基于对肠神经元分析，而只有有限数量的研究在ASD背景下研究了肠胶质细胞。因此，本综述主要关注涉及肠神经元的研究。
2 肠神经系统（ENS）
2.1 肠神经系统（ENS）概述
ENS是自主神经系统的分支，本身属于外周神经系统，分布于整个消化道的肠壁内。ENS的发育已在别处广泛综述。在此，研究人员基于主要在小鼠中进行的研究，提供当前知识的最新总结。ENS发育始于胚胎期（E）9.5，迷走神经肠神经嵴细胞（ENCCs）从外胚层胚胎层的神经嵴迁移至前肠，沿头尾方向进行。在迁移过程中，ENCCs在迁移波前的上游（在未来的肌间神经丛（MP）水平）增殖并分化为肠神经元和胶质细胞。随着ENCCs聚集并在肌间层形成神经节，神经突延伸，小肠中一部分祖细胞开始径向投射向黏膜，至E15.5形成黏膜下神经丛（SMP）。ENCCs对肠道的定植在E15.5完成。ENS成熟在出生后继续，通过轴突长度和分支的增加，以及轴突束化和突触形成进行。这些迁移、增殖和分化过程受到微环境中复杂的转录因子和信号分子网络的严格调控。它们共同导致ENS形成两个不同的神经节化神经元丛，即MP和SMP。MP位于纵行肌和环形肌层之间，而SMP位于黏膜下方。MP主要通过协调平滑肌收缩来调节肠道运动，驱动管腔内容物推进。反射活动由内在初级传入神经元（IPANs）启动，这些神经元检测机械刺激和管腔化学信号。IPANs表达多种神经递质，包括乙酰胆碱（Ach）、CGRP、钙结合蛋白和速激肽，并在肌间神经丛内与上行和下行中间神经元形成突触。上行中间神经元通过释放ACh和脑啡肽调节兴奋性运动神经元活性，而下行中间神经元通过乙酰胆碱和5-羟色胺（5-HT）控制抑制性运动神经元。产生Ach和P物质的运动神经元诱导平滑肌的口侧收缩，而产生一氧化氮（NO）和血管活性肠肽（VIP）的运动神经元诱导肛侧松弛。除了运动控制，ENS还通过位于SMP中的分泌运动神经元调节肠道通透性。在该神经丛内，血管运动神经元也参与调节血管舒张。分泌运动神经元和血管运动神经元都表达ACh和VIP。虽然ENS能够独立于中枢神经系统（CNS）运行，但肠道在解剖学和功能上通过迷走、交感神经和盆腔通路与CNS相连。特别是，迷走神经支持这两个器官之间的双向通信，其大约90%的纤维是传入纤维。出生后，胃肠道被微生物群定植，它们有助于ENS的发育和功能。肠道微生物群通过调节肠神经元存活和促进神经发生，对于维持ENS完整性至关重要。对无菌小鼠的研究表明，早在出生后第3天，与常规定植小鼠相比，ENS表现出神经元密度降低和氮能神经元比例增加（通过表达神经元型一氧化氮合酶（nNOS）——NO合成的酶来识别），提示肠道微生物群在出生后神经元可塑性中的作用。在成年小鼠中，肠道微生物群已被证明以5-羟色胺（5-HT）依赖的方式影响ENS结构，导致肠道转运改变。肠道微生物群对ENS影响的机制之一涉及调节肠神经元转录谱，特别是通过诱导肠神经元中芳烃受体（AhR）的表达，从而调节控制肠道运动的神经源性程序。肠道微生物群还通过调节肠胶质细胞在肠道黏膜和回肠肌间神经丛中的初始定植和稳态来影响它们。总体而言，这些研究强调了微生物定植在塑造ENS发育和功能中的重要作用。
2.2 人类ASD相关胃肠道疾病中的ENS改变
与ENS在调节GI生理学中的核心作用一致，ENS的结构和功能改变与多种GI疾病相关。这些紊乱可能源于影响ENS发育的基因突变，以及神经化学编码、神经元密度或连接性的改变，最终导致损害GI转运的运动障碍。关于ENS在GI病理学中的参与，读者可参考最近的综述。
GI障碍是ASD个体中最常见的共病之一，在自闭症儿童中的发生率是神经典型个体的4.4倍。便秘是最常报告的症状，其次是腹泻和腹痛。尽管患病率很高，但迄今为止尚无组织病理学研究检查ASD患者肠道活检中的ENS改变。然而，可以在ASD中观察到的GI症状与其他已记录ENS改变的消化系统疾病报告的症状之间进行类比。例如，在慢传输型便秘患者中，结肠活检显示ENS异常，如肌间和黏膜下神经丛中神经节尺寸和密度降低的神经节发育不良。此外，在慢性便秘个体中描述了肠神经元的神经化学表型变化，包括结肠中氮能神经元密度增加，同时VIP能和胆碱能神经元密度降低。ASD儿童中常见的其他症状，如腹泻、腹痛和腹胀，目前缺乏直接证据将其与人类ENS改变联系起来，即使在自闭症背景之外。值得注意的是，这些症状中的许多也是肠易激综合征（IBS）等疾病的特征，这些疾病具有重叠的临床特征，包括腹痛伴腹泻或便秘，或两者兼有。重要的是，超过一半的自闭症儿童可能表现出IBS样GI共病。遗传研究进一步支持这种关联，揭示了ASD和IBS之间部分共享的遗传结构，这可能部分解释它们频繁的共病。在IBS中，肠道黏膜活检显示神经纤维密度增加和神经突生长增强，尽管ENS在这些变化中的确切贡献尚未确认。考虑到功能性便秘和便秘型IBS与肠道微生物群失调相关，并且结肠转运时间是肠道微生物群组成的关键决定因素，慢性便秘可能改变微生物群落并继发影响ENS。
然而，ENS的结构和完整性尚未在ASD患者中直接研究，因为目前大多数可用证据来自ASD的遗传或环境动物模型，如下文所述。
2.3 ASD动物模型中ENS的改变
许多ASD动物模型一致地证明了大脑的改变；然而，多项研究也报告了其他系统的变化，包括ENS。在ASD的遗传和环境模型中都观察到了ENS的主要缺陷，最近已有综述。在此，研究人员通过纳入ASD动物模型中ENS改变的最新发现，提供更新的概述。
动物模型已成为研究ASD相关病理生理学、行为和大脑改变的重要工具。鉴于ASD中GI障碍的高患病率，越来越多的研究现在也关注于识别消化道功能障碍的病理生理机制，特别关注ENS。
ASD的遗传动物模型主要依赖于携带在ASD个体中鉴定的ASD易感基因突变的转基因小鼠。这些基因主要编码参与神经回路发育的蛋白质，特别是那些涉及突触形成和功能的蛋白质。最初，这些模型通过行为评估和脑连接性评估来研究其对中枢神经系统的影响。然而，ASD中高GI共病率（可能与ENS异常有关）促使人们重新评价其对消化功能和ENS结构的影响。
几个ASD相关基因变异已被证明在ENS发育过程中破坏肠神经元祖细胞的迁移。最近一项研究强调了参与这些过程的关键基因，包括SYNGAP1和SCN2A（编码神经传递的关键蛋白质）、DYRK1A（编码一种激酶）以及染色质调节基因，如CHD2和CHD8。这些遗传改变在体内损害神经祖细胞迁移，可能有助于ASD个体中常见的肠道运动障碍。
在斑马鱼模型中，CHD8突变与肠神经元数量减少相关，进一步支持ASD相关遗传改变与ENS异常之间的联系。在靶向突触相关基因的小鼠模型中也报告了肠神经元密度的变化。携带neuroligin 3基因Nlgn3 R451C突变的小鼠，与野生型小鼠相比，空肠中氮能神经元密度增加，尽管Nlgn3敲除在肠道区域显示神经元数量无差异。尽管ENS表型存在这些差异，两种模型都显示出加速的小肠转运。此外，缺乏Shank3B（一种对突触传递重要且与ASD相关的突触支架蛋白）的小鼠，显示结肠肌间神经丛中肠神经元密度增加。相比之下，携带Shank3a/b C端移码突变的斑马鱼模型未显示肠神经元数量的改变。然而，两种模型都表现出消化系统运动障碍，特征为蠕动收缩减少和转运时间延长。
另一个ASD小鼠模型缺乏接触蛋白相关蛋白样2（CNTNAP2），该基因编码一种对神经元回路发育重要的细胞粘附分子，并在一些ASD个体中发生突变，该模型显示肠神经元或胶质细胞数量无变化。然而，CNTNAP2缺失影响结肠运动，在空结肠中减少转运时间，同时在管腔刺激存在下加速转运。
Margolis等人描述了在携带丙氨酸56突变或删除5-羟色胺（5-HT）转运体SERT的动物模型中的ENS改变。5-HT信号失调也与ASD有关。特别是，色氨酸羟化酶2（TPH2）（5-HT合成的限速酶）的缺失与自闭症相关行为表型相关，包括大鼠社交行为和发声模式的改变。在TPH2敲除小鼠中，ENS异常包括肌间神经元密度降低以及多巴胺能和GABA能神经元比例改变，这与肠道转运减少和胃排空加速相关。
ENS结构异常也在特发性模型中进行了描述。BTBR小鼠携带Itpr3tf和T+位点的突变，显示前胼胝体严重异常，类似于ASD儿童中观察到的胼胝体体积减少。除了核心行为特征（如重复行为增加、社交和沟通能力受损）外，这些小鼠还表现出GI和ENS功能障碍，表现为肠道转运延迟、肌间神经丛中肠神经元密度降低以及神经节间距离增加。
环境因素在ASD病因中也起重要作用。然而，相对较少的环境模型检查了ENS完整性。在母体免疫激活模型中，报告了降钙素基因相关肽（CGRP）水平降低，CGRP是一种参与调节结肠肠道炎症的神经肽。另一个基于产前暴露于丙戊酸（一种用于治疗癫痫和情绪障碍的药物）的模型显示ENS改变，特征为肠神经元中PGP9.5表达降低。这些效应与肠道转运时间增加相关。
总体而言，这些研究表明，最初以其行为障碍和脑神经元功能障碍为特征的ASD动物模型，也表现出GI功能障碍，最显著的是肠道转运改变。在几个模型中，观察到ENS结构异常，通常反映为肠神经元数量的变化。然而，这些改变在各模型之间并不一致，因为一些模型未能显示可检测的ENS变化。重要的是，大多数研究依赖于有限的一组参数，通常仅限于肠神经元计数，从而仅提供对ENS内结构和功能变化的部分理解。未来的研究应旨在采用更全面的方法，以更好地表征ENS在结构水平（如突触连接性）和功能水平（如神经元活性和神经递质释放）上的改变。
3 肠道微生物群
3.1 ASD中肠道微生物群的改变
肠道微生物群是一个高度多样且复杂的微生物群落，主要由属于两个主要门（厚壁菌门和拟杆菌门）的细菌组成，它们分别约占细菌总数的70%和20%。除了维持肠道稳态的作用外，越来越多的证据表明，肠道微生物群在调节脑生理和行为功能方面发挥重要作用。在ASD个体中，多项研究报告了与神经典型对照相比，在不同地理区域和人群中肠道微生物组成的改变。然而，尽管文献数量不断增加，尚未识别出ASD特有的单一、一致的微生物特征。相反，观察到显著的研究间变异，可能反映了年龄、饮食、地理、临床异质性、胃肠道共病、测序方法和分析方法的差异。然而，大量研究一致表明，ASD个体与神经典型受试者之间在整体微生物群落组成上存在显著差异。在最常报告的改变中，在几个ASD儿童队列中描述了与对照组相比厚壁菌门/拟杆菌门比例增加，尽管也发现了相反的结果。在属水平上，多个属的相对丰度显著增加，包括Dorea、Lachnospiraceae、Clostridiales、Collinsella、Akkermansia、Clostridium和Lachnoclostridium，而Parasutterella、Faecalibacterium、Paraprevotella、Bifidobacterium和Bacteroides在ASD组中显著低于对照组。重要的是，某些属（如Erysipelotrichaceae和Lachnoclostridium）与ASD症状严重程度呈正相关，提示微生物失调与临床结局之间存在功能联系。然而，一项在儿童中进行的粪便宏基因组学研究报告了肠道微生物组与ASD行为症状之间的弱关联，但与饮食多样性较低、粪便稠度和年龄存在显著关联。关注早期儿童的前瞻性纵向研究（从5到36个月龄）揭示了ASD高可能性婴儿（即ASD儿童的兄弟姐妹）与低可能性婴儿（即无ASD家族史的婴儿）相比，肠道微生物群组成和代谢组学谱的不同发育轨迹。这些微生物群发育的差异，涉及Bifidobacterim、Clostridium和Klebsiella物种，可能在这一关键发育窗口期间不同地影响CNS和ENS成熟，潜在地影响以后生活中的行为和胃肠功能。在便秘亚群中，ASD症状严重程度与Fusobacterium、Barnesiella、Allisonella、Coprobacter、Actinomycetaceae和Olsenella的相对丰度相关。成人ASD人群的肠道微生物群组成比儿童和青少年人群研究得少。一项在无智力障碍的ASD成人中进行的研究显示，微生物群组成的变化仅限于Ruminiclostridium、Bacteroides和Desulfovibrio属，这些属在ASD组中比神经典型个体更丰富。
3.2 患者粪便微生物群移植到小鼠中
虽然大量研究一致报告了儿童、青少年和成人ASD人群中肠道微生物群组成的改变，但这些变化是否导致ASD相关行为和GI障碍仍不清楚。为了直接解决肠道微生物群对ASD症状学的贡献，将来自ASD儿童的粪便微生物群接种到无菌小鼠中，以分析对行为和消化功能的影响。这种人类粪便微生物群移植（FMT）在接受ASD供体粪便微生物群的小鼠中，在处理后3周内诱导了ASD样行为表型，特征为重复行为增加和社交能力降低。用于FMT的小鼠品系（BALB/c vs. C57BL/6）似乎在诱导的行为表型严重程度中起重要作用，提示遗传易感性、肠道微生物群和行为之间存在复杂的相互作用。行为改变伴随着与来自神经典型对照的微生物群定植的小鼠不同的微生物群落结构。此外，在ASD接受组中检测到色氨酸和5-羟色胺代谢通路的显著破坏，以及短链脂肪酸粪便浓度的改变。另一项研究表明，用来自ASD儿童的粪便微生物群定植无菌小鼠也影响了它们的后代。ASD定植小鼠的后代表现出ASD样行为改变，包括社交能力缺陷和重复行为增加。与这些行为表型一致，在后代中也描述了CNS神经元兴奋性的改变。后一项研究表明，围产期因素（如微生物群组成改变）可能通过增加ASD相关症状的风险和严重程度，从而促进自闭症的病因。
尽管有这些发现，微生物群移植对ENS的影响仍然很大程度上未探索。因此，需要进一步研究来阐明肠道微生物群失调在ENS结构和功能中的作用。
3.3 粪便微生物群移植作为治疗ASD的潜在治疗工具
FMT也已被探索作为缓解ASD患者行为和GI症状的潜在治疗干预。Kang等人对7至17岁的ASD儿童进行FMT，通过口服或直肠给药持续10周，随后进行8周观察期。结果与未治疗的神经典型个体进行比较。该研究报告了治疗结束时GI症状减轻约80%，包括便秘、腹泻和腹痛的显著改善。临床评估进一步显示核心行为ASD症状的显著改善。值得注意的是，GI和行为益处都在治疗结束后至少持续8周。同一组随后在治疗结束后2年对相同参与者进行了后续研究。他们的结果显示，在GI症状和微生物群组成方面观察到的大多数改善得以维持，而行为症状则进一步改善。这些发现表明FMT在缓解ASD个体GI和行为症状方面的长期安全性和潜在疗效。一项后续研究同样报告了ASD儿童FMT导致行为和GI症状改善，同时血清神经递质水平发生变化。研究人员进一步观察到，FMT促进了供体来源细菌的定植，并将ASD患者的细菌群落转向更接近典型发育对照或供体的组成。在严重ASD病例中，Hu等人进行了一项研究，在14周内对一名对长期行为干预反应有限的儿童进行5轮FMT。FMT后，核心ASD症状和GI障碍均显著改善，同时功能发育增强。此外，最近的几项研究使用不同的FMT方法（包括口服和直肠给药）也证明了在ASD患者行为和GI症状方面的有益效果。总体而言，这些研究强调了肠道微生物群在调节ASD相关行为和GI异常中的作用，并强调了其作为管理ASD症状的治疗靶点的潜力。然而，需要涉及更大患者队列和良好对照安慰剂组的进一步研究来确认这些发现。尽管多项研究报告了FMT对GI功能的有益效果，但据研究人员所知，尚无研究分析FMT对ENS重塑的影响。其他使用特定益生菌的策略也改善了ASD的行为症状。益生菌，特别是Lactobacillus、Bifidobacterium和Streptococcus菌株，已在66%的患者中显示出缓解行为性和胃肠道症状的潜力。研究表明，Lactiplantibacillus plantarum的不同菌株通过增强肠道健康、改善GI功能和减少行为症状，积极影响ASD动物模型和患者，突显了其治疗潜力。
4 自闭症中肠道微生物群与ENS之间的相互作用
上述研究强调了肠道微生物群作为导致ASD中行为和胃肠道症状的潜在因果因素的作用。尽管肠道微生物群影响大脑和消化功能的机制尚未完全了解，但它们似乎涉及几类微生物群衍生代谢物，这些代谢物通过调节多种细胞过程作用于靶器官。在ASD背景下，相对较少的研究专门检查了失调/改变的微生物群如何影响ENS。值得注意的是，Gonzales等人研究了从诊断为ASD的成人粪便中分离的粪便上清液的效果。过滤后，粪便上清液没有细菌，但含有大量微生物群衍生分子，包括代谢物和膜相关化合物。这项研究表明，从ASD成人转移的粪便上清液，无论是应用于体外原代ENS培养物还是体内给予小鼠，都会诱导ENS改变，特征为胶质和神经元分子表达降低。特别是，参与神经元连接性的蛋白质，如βIII-微管蛋白和突触蛋白-1，显著下调。这些发现表明，来自ASD患者失调肠道微生物群的介质可以通过直接或间接途径诱导ENS重塑，尽管本研究未识别出负责的具体分子。在下一节中，研究人员将描述在ASD背景下观察到的各类细菌衍生代谢物的改变，包括短链脂肪酸、琥珀酸、类固醇激素、胆汁酸、色氨酸衍生物和四氢生物蝶呤。该概述基于临床研究和动物模型的证据，并重点关注已证明对ENS具有调节作用且可能潜在地导致ASD中观察到的GI症状的代谢物。
4.1 短链脂肪酸（SCFAs）
SCFAs是微生物碳水化合物发酵的终产物，反映肠道微生物群组成和膳食纤维摄入。多项研究检查了ASD个体粪便中的SCFA水平，包括丁酸、丙酸、乙酸和戊酸。虽然一些研究报告SCFA浓度降低，但其他研究描述了水平升高。总体而言，这些发现表明，ASD个体的SCFA谱发生改变，患者之间存在显著个体间变异。在生理条件下，丁酸、丙酸和乙酸已被证明通过作为结肠细胞能量底物来调节全身代谢，在肠道稳态中发挥关键作用。此外，SCFAs可以调节肠神经元活性和胃肠运动。SCFAs已被证明通过降低纵行肌自发性收缩频率来影响结肠运动。这种效应被河豚毒素（一种阻断神经元动作电位的钠通道阻滞剂）消除，提示SCFAs通过激活ENS作用于纵行肌收缩。多项研究进一步支持SCFAs在调节ENS神经元功能和神经化学表型中的作用。Fung等人证明，在小鼠结肠制剂中，乙酸、丙酸和丁酸可以通过急性刺激肠神经元中Ca
2+信号直接与ENS通信。体内给予幼年大鼠的丁酸诱导了结肠中胆碱能和氮能神经元百分比增加，而成年大鼠中仅胆碱能神经元群体增加。将丁酸应用于ENS原代培养物，通过涉及单羧酸转运体2（MCT2）的机制增加了胆碱能神经元比例，MCT2在肠神经元中表达并促进SCFA跨细胞膜转运。随后，丁酸可能通过激活Src家族激酶促进组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性抑制，后者促进组蛋白3上赖氨酸9的乙酰化（H3K9）。这些结果与丁酸影响参与肠神经元增殖的细胞周期和氧化磷酸化途径的能力一致。此外，丁酸已被证明可以诱导细胞内Ca
2+释放，导致K
+通道激活，进而使肠神经元超极化，并通过增加其兴奋性激活IPANs。除了调节组蛋白去乙酰化酶活性外，SCFAs还通过激活游离脂肪酸受体（特别是游离脂肪酸受体3（FFAR3，也称为GPR41））发挥许多作用。与其他SCFA受体相比，FFAR3在黏膜下和肌间神经丛的肠神经元中高度表达，并在调节肠道运动中起关键作用。FFAR3的激活抑制由烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）激活诱导的神经活动和氯离子分泌，并抑制肠道运动变化。总之，SCFAs可以直接调节肠神经元的神经化学编码和活性，从而在生理上影响ENS介导的肠道运动。ASD个体中报告的SCFA水平改变因此可能影响肠神经元功能和肠道运动，潜在地导致GI疾病。仍需要进一步研究以更好地理解SCFAs在ASD相关GI疾病中的作用，并支持开发其管理的药理学或饮食干预。
4.2 与碳水化合物代谢相关的肠道细菌衍生代谢物
琥珀酸和乳酸是与碳水化合物代谢相关的两种特定代谢物，已被发现在ASD患者中发生改变。琥珀酸是克雷布斯循环的中间分子，在碳水化合物、蛋白质和脂肪分解代谢过程中在线粒体中产生和代谢。在肠道中，琥珀酸是微生物将不可消化的饮食和宿主衍生碳水化合物发酵成SCFAs的中间代谢物。几种细菌分类群，包括Bacteroides spp.、Prevotella spp.、Firmicutes spp.，能够在肠道中代谢戊糖和己糖碳水化合物以产生琥珀酸。在来自美国肠道项目数据库的ASD患者队列中，肠道微生物群分析揭示Prevotella spp.增加，琥珀酸被确定为与该人群中观察到的细菌特征相关的显著代谢物。此外，在36月龄时，ASD高风险婴儿与低风险婴儿相比显示粪便琥珀酸水平升高。相应地，其他研究报告了ASD儿童血浆琥珀酸水平升高。微生物群衍生的琥珀酸已被发现作为抗生素诱导的肠神经元丢失后的恢复机制的一部分，在体内刺激神经元分化。然而，尚需确定琥珀酸是通过直接作用ENS前体还是间接通过与其他肠道驻留细胞类型相互作用来介导神经元恢复。一种可能性是，ASD个体中升高的琥珀酸水平可能通过增加神经元分化来影响肠神经元稳态，从而有助于肠道生理稳态的紊乱。乳酸是线粒体功能障碍的生物标志物，指示线粒体碳水化合物代谢异常。在ASD患者中显示出脑和血乳酸水平升高。在肠道中，产生乳酸的细菌（如乳酸杆菌）在ASD患者粪便中报告升高。产生乳酸的细菌可以表达谷氨酸脱羧酶（GAD），将谷氨酸转化为GABA（CNS和ENS的神经递质），从而促进其积累，特别是在小鼠小肠中。乳酸也是神经元的重要能量底物，并作为调节神经元兴奋性的信号分子。ASD中报告的乳酸水平升高可能影响肠神经元中的代谢信号传导和兴奋性。
4.3 类固醇激素
已鉴定出超过1000种天然存在的类固醇，包括内源性性类固醇激素（雄激素、雌激素和孕激素）和皮质类固醇，分别由性腺和肾上腺产生。鉴于ASD患病率的性别差异（男女比例约为4:1），已研究了性激素水平与ASD之间的潜在联系。最近的荟萃分析表明，与年龄和性别匹配的对照相比，ASD个体血清和粪便雄激素水平（如游离睾酮和二氢睾酮）升高。此外，孕酮代谢物别孕烯醇酮在成年ASD男性血清中显示水平降低。类似地，在丙戊酸诱导的ASD大鼠模型中，与对照大鼠相比，观察到类固醇激素生物合成增加。有趣的是，肠道微生物群可以影响类固醇激素水平，因为几种细菌物种表达能够代谢类固醇激素的酶。例如，几种细菌物种产生β-葡萄糖醛酸酶（GUS），这是一种将无活性的雌激素转化回其活性形式的酶。GUS酶也参与二氢睾酮（DHT）和睾酮的去葡萄糖醛酸反应，从而激活这些激素。此外，某些肠道细菌能够产生性类固醇激素的衍生物，如别孕烯醇酮（孕酮的代谢物），以及孕激素，通过21-脱羟基化转化胆汁中的糖皮质激素。类似地，其他细菌（如Clostridium scindens）表达类固醇-17,20-去甲基酶，这是一种将糖皮质激素转化为11β-羟基雄烯二酮（雄激素前体）的酶。一致地，抗生素诱导的小鼠微生物耗竭导致血清睾酮水平降低，提示雄激素水平部分依赖于微生物活性。性类固醇激素的作用超越性别分化和生殖，因为它们参与多个生理系统，包括肠道和CNS。有趣的是，雄激素受体（AR）表达已在肠神经元中被鉴定，AR信号在维持成年小鼠正常结肠运动中起关键作用。特别是，小鼠微生物耗竭已被证明会降低血清睾酮水平并消除肠神经元中AR的表达，导致结肠运动障碍。有趣的是，大多数AR阳性肠神经元是氮能神经元，表达神经元型一氧化氮合酶，而胆碱能肠神经元不表达AR，提示雄激素信号可能仅限于蠕动反射回路中的抑制性成分。这些发现提示，在ASD背景下，雄激素分子（如睾酮或二氢睾酮）的血清水平升高可能特异性地影响ENS氮能信号，潜在地导致结肠运动障碍。此外，性类固醇激素可以调节神经元中神经递质介导的信号传导。例如，别孕烯醇酮作为GABA-A受体的调节剂，GABA-A受体在CNS和ENS中均有表达，并参与调节结肠收缩。在ASD条件下，血清别孕烯醇酮水平降低可能改变肠神经元中GABA-A受体信号，然后潜在地影响结肠收缩性。
4.4 胆汁酸（BAs）
初级胆汁酸（BAs）由胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）组成，在肝脏中从胆固醇合成，并由胆囊分泌到肠道中以促进脂质消化和吸收。初级BAs也作为底物，通过肠道微生物群产生次级BAs。主要的次级BAs——去氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）——由肠道微生物群通过连续的微生物酶促反应产生，包括去结合（即去除甘氨酸或牛磺酸部分）然后分别对CA和CDCA进行7α-脱羟基化。与对照组相比，ASD个体中报告了粪便DCA水平升高。此外，在BTBR T+ Itpr3tf/J小鼠品系（ASD的特发性模型）中，发现次级BA谱失调。在该模型中，观察到能够产生次级BAs的肠道细菌分类群（如Bifidobacterium和Blautia）丰度降低。这些微生物和代谢改变与GI障碍和ENS变化相关，特征为肌间神经丛中肠神经元数量减少，特别是在氮能神经元群体中。因此，次级BA水平的变化（由于细菌产生或宿主代谢失衡）可能有助于ASD背景下的消化系统疾病和ENS异常。在小鼠研究中，DCA给药通过涉及ENS的机制增加了肠道运动和通透性。相应地，DCA已被证明通过与胆汁酸受体TGR5相互作用直接调节肠神经元活性，TGR5由肠神经元表达。
4.5 色氨酸代谢
在体内，色氨酸主要通过三种主要途径代谢：吲哚衍生物途径、犬尿氨酸途径（占饮食色氨酸代谢的90%以上）和5-羟色胺（5-羟色胺，5-HT）途径。在肠道中，大约5%的饮食色氨酸通过肠道微生物群的吲哚途径代谢。吲哚衍生物如吲哚-3-丙酮酸（IPYA）、吲哚-3-醛（IAld）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-丙酸（IPA）、吲哚-3-乙醛（IAAld）和吲哚丙烯酸是芳烃受体（AhR）的已知配体。色氨酸代谢越来越被认为是ASD病理生理学的重要贡献者。最近一项研究表明，ASD患者粪便中特定色氨酸相关代谢物（包括犬尿喹啉酸）水平显著降低，并与脑岛和扣带回皮层的活动改变相关，这些脑区先前与ASD严重程度和症状学相关。在肠道水平，肠道细菌Lactobacillus spp.（也已知是AhR配体的生产者）在ASD患者粪便中报告升高。AhR信号在维持肠道稳态中发挥作用，包括肠道屏障更新和完整性以及调节不同免疫细胞类型。肠神经元表达AhR，已被证明
