整合方法用于从塞拉多（Cerrado）植物中发现抗真菌与抗生物膜（Antibiofilm）剂

《Chemistry & Biodiversity》：Integrated Approach for the Discovery of Antifungal and Antibiofilm Agents From Cerrado Plants

　　

研究人员指出，白色念珠菌（Candida albicans）感染发病率不断增加，尤其是涉及耐药菌株的感染，凸显了对新型抗真菌剂的迫切需求。在这项研究中，研究人员筛选了108种来自巴西塞拉多（Cerrado）原生及特有植物的提取物，针对白色念珠菌（Candida albicans）的浮游（Planktonic）和生物膜（Biofilm）形式（发育期与成熟期）进行了评估。十八种提取物表现出显著的抗真菌与抗生物膜（Antibiofilm）活性，特别是来自豆科（Fabaceae）、桃金娘科（Myrtaceae）和卫矛科（Celastraceae）的物种。其中，Hymenaea stigonocarpa的提取物显著抑制了酵母向菌丝的转变这一关键毒力因子。利用分子网络（Molecular Networking，GNPS）和计算机模拟（In silico）工具（SIRIUS），研究人员注释了60种推定化合物，包括呫吨酮（Xanthones）、黄酮类（Flavonoids）和三萜类（Triterpenoids），选定的候选化合物在分子对接（Molecular Docking）分析中显示出良好的结合谱。这种整合代谢组学方法能够识别生物活性骨架，强化了塞拉多（Cerrado）生物群落作为结构多样化代谢产物宝贵来源在抗真菌药物发现中的价值。

该研究发表于《Chemistry》。目前，白色念珠菌（Candida albicans）感染发病率不断上升，尤其是耐药菌株的出现，使得寻找新型抗真菌剂成为紧迫需求。念珠菌属（Candida spp.）虽为正常人体微生物群的一部分，但在免疫受损条件下可致感染，约80%的重症监护室感染由其引起，治疗延迟时患者死亡风险高达98%。念珠菌属（Candida spp.）生物膜（Biofilm）的形成通过显著增加对传统抗真菌药如唑类（Azoles）和两性霉素B（Amphotericin B）的耐药性构成重大治疗挑战，其机制涉及细胞生理、胞外聚合物、外排泵过表达及甾醇含量改变。天然产物可通过靶向替代途径发挥抗真菌作用，如抑制生物膜形成、破坏细胞壁及诱导凋亡。白色念珠菌（Candida albicans）的外-β-1,3-葡聚糖酶（Exo-β-1,3-glucanase，Exg）系统在掩蔽免疫原性β-葡聚糖中起关键作用，是具吸引力的抗真菌靶点。塞拉多（Cerrado）作为巴西第二大生物群落，面临生存威胁，但其植物提取物库蕴含巨大生物勘探价值。鉴于此，研究人员调查了108种塞拉多（Cerrado）原生植物提取物对白色念珠菌（Candida albicans）的抗真菌及抗生物膜（Antibiofilm）活性，并整合高分辨质谱与分子网络（Molecular Networking）将生物活性与化学轮廓关联。

研究人员开展的主要关键技术方法包括：针对白色念珠菌（Candida albicans）ATCC标准株及临床分离株（S1、S3等）的浮游（Planktonic）细胞最小抑菌浓度（MIC）测定、生物膜（Biofilm）形成与成熟抑制评估及酵母-菌丝形态转换抑制实验；利用UPLC-MS/MS进行化学分析，结合全球天然产物分子网络（GNPS）与SIRIUS进行特征基于分子网络（FBMN）构建与化合物注释；应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）与随机森林（Random Forest）进行代谢组学统计分析；采用DockThor平台进行计算机模拟（In silico）分子对接（Molecular Docking）及SwissADME预测ADMET性质。样本来源于巴西塞拉多（Cerrado）植物库及医院临床分离株。

2 Results and Discussion

2.1 Screening Against Candida albicans Biofilm

研究人员通过在固定浓度250 μg mL^?1下初筛，以抑制率≥50%为活性 cutoff，从108种提取物中筛选出18种对生物膜发育或成熟具有活性的提取物。活性样品中乙酸乙酯（Ethyl acetate）提取物占25%，乙醇（Ethanol）占13%，己烷（Hexane）占9%，表明中等极性溶剂提取的化合物如萜类、黄酮类与抗生物膜（Antibiofilm）活性相关。豆科（Fabaceae）的Vatairea macrocarpa根木乙酸乙酯提取物与Tachigali vulgaris茎木乙酸乙酯提取物分别对生物膜发育和成熟抑制率达67.59%和65.88%。部分提取物对发育期与成熟期抑制差异显著，如Myrcia linearifolia对成熟期抑制更高，而Blepharocalyx salicifolius仅对发育期有效。

2.2 Antibiofilm Activity Against Candida albicans Clinical Strains

在18种活性提取物中，约66%对临床分离株S1或S3生物膜形成抑制>50%，但仅39%对两株均有效，显示临床株生物膜耐药性更强。无提取物在测试条件下对S3成熟生物膜抑制>50%，而对S1成熟生物膜有8种提取物抑制率达61.95%–77.23%，其中Hymenaea stigonocarpa叶己烷与乙酸乙酯提取物、Myrcia linearifolia根与地上部乙酸乙酯提取物及Tachigali vulgaris茎木乙酸乙酯提取物被认为是最有前景的候选物。敏感性分析证实生物膜评分（Bioactive Score，BS） cutoff的稳健性。

2.3 Activity Against Planktonic Cells

13种提取物对浮游（Planktonic）细胞MIC ≤ 125 μg mL^?1被分类为活性。Sclerolobium aureum茎木乙醇提取物对白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231和热带念珠菌（Candida tropicalis）LMGO49的MIC达0.49 μg mL^?1，其根木乙酸乙酯提取物对S1、S3的MIC < 2 μg mL^?1。Andira humilis根皮乙酸乙酯提取物对ATCC 28367和S1的MIC为15.6 μg mL^?1，对其他株为3.9 μg mL^?1。Hymenaea stigonocarpa叶乙酸乙酯提取物显示菌株依赖性，对S1、S3的MIC分别为31.2和15.6 μg mL^?1，对非白色念珠菌（Non-albicans）为7.8 μg mL^?1。Cheiloclinium cognatum叶乙醇提取物对非白色念珠菌（Non-albicans） MIC为15.6 μg mL^?1。

2.4 Inhibition of Yeast-to-hyphae Morphological Transition

在血清诱导条件下，研究人员观察到Hymenaea stigonocarpa提取物处理组在p < 0.01水平显著抑制白色念珠菌（Candida albicans）S1株酵母向菌丝的形态转换。该物种含有的二萜（Diterpene）类化合物被认为与此抑制有关。

2.5 Spectral Similarity Networking Evaluation

通过UPLC-MS/MS与分子网络（Molecular Networking，GNPS）及SIRIUS分析，研究人员从活性提取物中注释了60种化合物，包括黄酮类、糖苷化黄酮类、萜类、二苯乙烯类（Stilbenes）、呫吨酮（Xanthones）、萘醌（Naphthoquinone）等。网络分析显示豆科（Fabaceae）富含糖苷化黄酮、异黄酮、儿茶素和二萜；桃金娘科（Myrtaceae）独有三萜和O-甲基化黄酮；卫矛科（Celastraceae）独有呫吨酮（Xanthones）。溶剂极性影响化学轮廓，己烷富集二萜，乙醇含鞣质与呫吨酮（Xanthones），乙酸乙酯多样性最广。器官特异性分布显示呫吨酮（Xanthones）、异黄酮与二萜在叶富集，非异戊烯化异黄酮在根，三萜在根与地上部，鞣质在茎/根，糖苷化黄酮遍布各器官。

2.6 Chemical Variation Among Plant Species and Its Relationship With Antifungal Activities

PLS-DA与VIP评分识别出与抑制菌丝形成相关的离子，包括Hymenaea stigonocarpa中的二萜如kauradienoic acid（m/z 301.2151）、15α-hydroxy-kauradienoic acid（m/z 317.2105）、nivenolide（m/z 333.2036）及糖苷化黄酮（m/z 611.1637）。随机森林（Random Forest）分析提示与临床株抗生物膜（Antibiofilm）相关的离子包括Cheiloclinium cognatum中的mangiferin（m/z 423.0928）及Myrcia linearifolia中的3-O-甲基黄酮（m/z 389.0879），这些作为与活性相关的化学标志物而非因果证明。

2.7 In Silico Activity

分子对接（Molecular Docking）显示mangiferin与白色念珠菌（Candida albicans）外-β-1,3-葡聚糖酶（Exo-β-1,3-glucanase）结合能为?8.8 kcal mol^?1，与Arg258（1.8 ?）、Glu255（1.9 ?）等残基形成氢键。(4S,5S,10S)-5,9-dimethyl-14-methylidene-15-oxotetracyclo[11.2.1.0^1,10.0^4,9]hexadecane-5-carboxylic acid结合能为?7.1 kcal mol^?1，grandiflorenic acid为?6.9 kcal mol^?1。Mangiferin与醛糖还原酶对接结合能?8.1 kcal mol^?1，Kauren与11β-羟基类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）为?9.1 kcal mol^?1。SwissADME预测mangiferin具有高极性（TPSA = 201.28 ?²）和高水溶性，利于与可溶性酶靶标相互作用。

讨论部分总结指出，本研究评估了108种塞拉多（Cerrado）植物提取物，证明了18种原生及特有物种提取物对念珠菌属（Candida spp.）显著的抗真菌与抗生物膜（Antibiofilm）潜力。豆科（Fabaceae）表现出显著的生物膜（Biofilm）抑制，特别是Tachigali vulgaris茎木乙酸乙酯提取物，而Sclerolobium aureum提取物对浮游（Planktonic）和生物膜（Biofilm）形式均有强效。Sclerolobium aureum因其对白色念珠菌（Candida albicans）及非白色念珠菌（Non-albicans）的广谱效力成为进一步研究的候选。UPLC-MS/MS化学轮廓分析鉴定了酚类、黄酮类和萜类等关键生物活性化合物。计算机模拟（In Silico）对接分析揭示了这些化合物与真菌靶蛋白的良好亲和力。尽管某些耐药临床株敏感性降低，整体发现强调了天然产物在寻找新型治疗药物中的相关性。Kaurenoic acid和mangiferin的良好亲和力暗示其在抗真菌以外的代谢与糖尿病疾病治疗潜力。综上，本研究凸显了塞拉多（Cerrado）生物群落生态与药理价值，支持持续生物勘探以创新治疗真菌感染，尤其在抗真菌耐药性上升背景下。

研究人员得出结论，本研究评估了108种来自塞拉多（Cerrado）生物群落的植物提取物，证明了18种来自原生及特有物种的提取物对念珠菌属（Candida spp.）具有显著的抗真菌和抗生物膜（Antibiofilm）潜力。值得注意的是，豆科（Fabaceae）显示出显著的生物膜（Biofilm）抑制作用，特别是Tachigali vulgaris茎木的乙酸乙酯（Ethyl acetate）提取物，而Sclerolobium aureum提取物对浮游（Planktonic）细胞和生物膜（Biofilm）形式均表现出强效活性。鉴于Sclerolobium aureum对白色念珠菌（Candida albicans）和非白色念珠菌（Non-albicans）物种的广谱功效，其作为进一步研究的候选者脱颖而出。通过UPLC-MS/MS进行的化学轮廓分析鉴定了关键的生物活性化合物，如酚类、黄酮类和萜类，强化了它们作为具有药理兴趣的生物活性分子的潜力。计算机模拟（In silico）对接分析通过揭示这些化合物与真菌靶蛋白的有利结合亲和力支持了这些发现。尽管一些耐药临床菌株表现出敏感性降低，但总体发现强调了天然产物在寻找新型治疗药物中的相关性。此外，kaurenoic acid和mangiferin的良好亲和力表明了它们在抗真菌治疗之外的潜在应用，包括代谢和糖尿病疾病的治疗。总之，本研究凸显了塞拉多（Cerrado）生物群落的生态和药理价值，并支持持续开展生物勘探工作，以针对真菌感染特别是抗真菌耐药性上升背景下的创新治疗。