黏连蛋白单倍体不足与inv(16)协同强化Fli1基因转录程序在急性髓系白血病起始和维持中的作用

《Leukemia》：Cohesin haploinsufficiency and inv(16) cooperate to reinforce Fli1 gene transcriptional programs during acute myeloid leukemia initiation and maintenance

　　

核心结合因子（CBF）急性髓系白血病（AML）通常携带t(8;21)或inv(16)易位。由于黏连蛋白突变在inv(16)中比在t(8;21)中少见，研究人员假设它们可能对inv(16)驱动的AML产生负面影响。利用inv(16)小鼠模型结合黏连蛋白亚基Smc3的单倍体不足，研究人员矛盾地发现，inv(16); Smc3Δ/+小鼠与inv(16); Smc3+/+小鼠相比，白血病潜伏期缩短，这否定了初始假设，反而表明黏连蛋白缺失在增强inv(16)驱动的疾病中发挥作用。与黏连蛋白单倍体不足改变染色质可及性的已知作用一致，研究人员在白血病发生前，在inv(16); Smc3Δ/+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中观察到染色质可及性增加，且Fli1 DNA结合基序富集。通过对白血病前期HSPCs进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员观察到短期造血干细胞（ST-HSCs）中Fli1表达增加，且Fli1靶基因表达增强。研究人员进一步证明Fli1对inv(16); Smc3Δ/+ AML的维持阶段至关重要。研究数据表明黏连蛋白缺失在增强inv(16)驱动的AML侵袭性中发挥作用，并确定Fli1是黏连蛋白突变AML中先前未被认识的治疗脆弱性。

研究背景：急性髓系白血病（AML）是骨髓造血系统恶性肿瘤，全球发病率和死亡率持续上升。约15%的成人AML患者携带核心结合因子（CBF）复合体突变，包括t(8;21)易位（引发RUNX1::RUNX1T1融合蛋白）和inv(16)倒位（引发CBFβ::SMMHC融合蛋白）。这两种突变虽为白血病起始所必需，但通常需要额外突变才能完全转化。黏连蛋白复合体（由SMC1A、SMC3、RAD21、STAG2亚基组成）突变在AML中发生率约10%，且多导致单倍体不足。有趣的是，黏连蛋白突变在t(8;21) AML中发生率高达18%–27%，但在inv(16) AML中极为罕见，这一现象提示黏连蛋白缺失可能对inv(16)驱动白血病起抑制作用。然而，研究人员通过小鼠模型发现相反结果，进而开展本研究，旨在阐明黏连蛋白单倍体不足与inv(16)协同促白血病发生的机制，并寻找潜在治疗靶点。

研究人员开展的研究：利用诱导型inv(16)小鼠模型（inv(16)^+/56M）与Smc3条件性敲除小鼠（Smc3^fl/+），通过pIpC注射激活Mx1-Cre，产生inv(16); Smc3^+/+（inv(16); Swt）和inv(16); Smc3^Δ/+（inv(16); Shet）小鼠。通过对比两组小鼠的白血病潜伏期，发现Smc3单倍体不足显著缩短疾病潜伏期。随后，在白血病前期造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中，利用ATAC-seq（分析染色质可及性）、scRNA-seq（单细胞RNA测序）、HOMER基序分析、pySCENIC调控网络分析、qPCR、Western blot以及shRNA敲低结合移植实验，系统探究了分子机制。论文发表在《Leukemia》。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用小鼠模型（inv(16)^+/56M和Smc3^fl/+，通过Mx1-Cre诱导，pIpC注射激活），从骨髓中分离Lin^- HSPCs或Lin^-Sca1⁺c-Kit⁺（LSK）细胞。应用ATAC-seq（测序技术分析全基因组染色质可及性）结合HOMER软件进行基序富集分析；使用10x Genomics平台进行scRNA-seq，结合pySCENIC识别转录因子驱动的调控网络；通过qPCR和Western blot定量mRNA和蛋白水平；利用慢病毒载体递送shRNA（shFli1）敲低Fli1，结合移植实验（CD45.1受鼠，CD45.2供体细胞）评估白血病维持。样本队列均来自小鼠骨髓HSPCs或白血病细胞。

研究结果：
Smc3 haploinsufficiency decreases the latency of inv(16) AML：通过生存曲线分析，inv(16); Shet小鼠中位白血病潜伏期（14周）显著短于inv(16); Swt小鼠（20周）（p<0.01），且白血病100%外显，形态学相似，表明Smc3单倍体不足加速inv(16)驱动疾病。

Smc3 haploinsufficiency increases chromatin accessibility at ETS family binding sites in pre-leukemic inv(16) HSPCs：通过ATAC-seq比较白血病前期HSPCs，inv(16); Shet细胞中独特可及染色质区域（33,133个）远多于inv(16); Swt（564个）。HOMER基序分析显示，ETS家族转录因子（包括Fli1、Etv1、Etv4、PU.1等）位点在inv(16); Shet独特可及区域中显著富集。此外，在独立Npm1c^A/+; Smc3^Δ/+模型中也观察到类似ETS基序富集，表明Smc3单倍体不足普遍增强ETS位点可及性。

Smc3 haploinsufficiency increases Fli1 expression and enhances Fli1 activity in pre-leukemic inv(16) HSPCs：qPCR和Western blot证实，inv(16); Shet HSPCs中Fli1 mRNA和蛋白显著上调，而Erg等仅mRNA上调。此外，Fli1靶基因（Ccl2、Ccng1、Mdm2、Rab27b、Lmo2）表达上调。将Fli1结合位点映射至邻近基因进行GO分析，发现Ras信号通路等癌相关通路富集，提示Fli1可能通过激活RAS下游基因促进白血病发生。

Fli1 is overexpressed and drives an enhanced gene expression program in inv(16); Shet HSCs：scRNA-seq分析LSK细胞，发现Fli1在短期造血干细胞（ST-HSCs）中显著上调，但在多能祖细胞（MPPs）中趋势不显著。pySCENIC分析显示，Fli1调控网络在inv(16); Shet细胞中活性显著高于inv(16); Swt（Z-score: 0.27 vs -0.22，p=2.2×10^-16）。进一步分析表明，在Fli1表达水平相当的细胞中，inv(16); Shet细胞的Fli1调控活性斜率（11.71）显著高于inv(16); Swt（6.13），说明黏连蛋白缺失增强Fli1驱动基因表达的能力。

Knockdown of Fli1 disrupts disease maintenance in inv(16); Shet leukemia：使用两个shRNA（shFli1 #1和#2）敲低inv(16); Shet白血病细胞中Fli1（mRNA敲低70%–80%，蛋白敲低60%–80%），移植后100天，5/6只shFli1组小鼠无白血病证据，而空载体组小鼠在37天内全部死亡。表明Fli1对inv(16); Shet白血病维持至关重要。

Smc3 haploinsufficiency results in a more aggressive leukemic phenotype compared to inv(16) alone：尝试在inv(16); Swt HSPCs中过表达Fli1或敲低Fli1均因移植失败而无法进行，间接说明Smc3单倍体不足导致白血病更具侵袭性。

讨论部分总结：研究人员发现，Smc3单倍体不足通过增加染色质可及性、富集Fli1结合位点、上调Fli1表达并增强其靶基因（尤其是Ras通路相关基因）活性，从而加速inv(16)驱动的白血病起始和维持。Fli1在白血病维持阶段不可或缺，且可能是黏连蛋白突变AML的潜在治疗靶点。尽管临床中inv(16)与黏连蛋白突变共发生频率低，但靶向测序可能发现更多病例。研究人员推测，Smc3单倍体不足可能部分模拟RAS激活突变的作用，使黏连蛋白突变在RAS突变背景下变得冗余。研究结论：研究数据表明黏连蛋白缺失在增强inv(16)驱动的AML侵袭性中发挥作用，并确定Fli1是黏连蛋白突变AML中先前未被认识的治疗脆弱性。