纵向血浆蛋白质组学预测临床显性肌萎缩侧索硬化症的表型转换

《Nature Medicine》：Longitudinal plasma proteomics predict phenoconversion to clinically manifest ALS

　　

前症状性肌萎缩侧索硬化症（ALS）的研究以及疾病预防试验的设计，因研究人员无法预测哪些未受影响的ALS相关致病变异携带者将在何时发生表型转换（phenoconversion）为临床显性疾病而受到极大阻碍。在这项纵向Olink Explore高通量蛋白质组学研究中，研究人员纳入了来自33名表型转换者、35名ALS患者、10名前症状性致病变异携带者和59名对照者的516份连续采集的血浆样本。研究人员识别出92种在表型转换前浓度发生变化的蛋白质；描述了这些蛋白质的纵向轨迹，并确定了一个由19种蛋白质组成的核心组，该组在0.5年至5年的时间范围内共同预测了表型转换（交叉验证曲线下面积0.80–0.89），并给出了表型转换时间的估计值，平均绝对误差为1.6年。这些发现在英国生物银行（UK Biobank）数据中得到部分重复，证实了多种蛋白质（例如NEFL、EDA2R和CA3）在前症状期的升高，且多蛋白组在估计表型转换时间方面优于单独使用NEFL。这项研究揭示了前症状性ALS的生物学机制。此外，研究人员基于经验性纵向数据识别出一组新的易感性/风险生物标志物，推进了ALS预防的最终目标。

**研究背景、问题及意义**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种神经退行性疾病，传统上基于临床表型定义，但越来越多的认识表明其存在前症状期和临床显性期。目前，预防前症状期向临床显性期转化（即表型转换）是ALS研究的重点，但主要障碍在于无法准确预测表型转换的发生时间和对象。既往研究主要依赖横断面蛋白质组学数据或对表型转换时间进行假设，缺乏基于纵向数据的前症状期生物标志物系统分析。为填补这一空白，研究人员利用Pre-fALS（前症状性家族性ALS）研究队列，该队列长期随访了高风险致病变异携带者，收集了表型转换前后的纵向血浆样本及临床数据，并结合对照和临床显性ALS患者数据，旨在发现可预测表型转换的易感性/风险生物标志物。该研究发表在《Nature Medicine》上，其意义在于首次系统描绘了从症状前到临床显性阶段的蛋白质生物标志物纵向轨迹，并为ALS预防试验的筛选策略提供了关键依据。

**主要关键技术方法**
研究人员采用Olink Explore HT平台对516份血浆样本进行高通量蛋白质组学分析，纳入样本来自三个母研究：Pre-fALS（单中心，招募北美ALS/FTD致病变异携带者）、CRiALS Biomarker研究（对照和临床显性ALS患者）及CReATe PGB1研究（多中心，仅限迈阿密大学站点）。统计方法包括：线性混合效应模型识别差异表达蛋白、基因本体论（GO）富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用网络分析、广义加性混合模型（GAMM）建模纵向轨迹、Cox比例风险模型及LASSO惩罚回归进行时间-事件分析、逻辑回归及贪婪逐步选择法构建预测模型、截断回归模型估计表型转换时间。独立验证采用英国生物银行（UK Biobank）的横截面蛋白质组学数据（Olink Explore 3072平台）。

**研究结果**
- **发现队列**：研究纳入137名参与者（包括33名表型转换者、35名ALS患者、10名前症状性携带者和59名对照），共516份血浆样本。表型转换者贡献了表型转换前后的纵向数据，对照组和临床显性组也提供多次采集样本。
- **疾病状态生物标志物及涉及的生物学通路**：通过比较临床显性ALS与健康对照，识别出137种差异表达蛋白（105种上调，32种下调）。GO富集分析显示，上调蛋白主要涉及骨骼肌功能通路，下调蛋白主要涉及细胞外基质（ECM）通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析识别出与骨骼肌、ECM、肿瘤坏死因子（TNF）信号正调控及神经再生（含神经丝）相关的簇。
- **前症状期和临床显性期生物标志物的时间进程**：对137种差异蛋白进行纵向轨迹分析，发现92种蛋白在表型转换前相对丰度（相对于年龄和性别匹配的对照）发生显著变化。其中，NEFL在表型转换前急剧升高，随后继续上升；CA3和EDA2R在表型转换前多年即开始升高；ART3等少数蛋白在表型转换前下降。
- **时间-事件分析**：Cox比例风险模型（基线蛋白水平，调整年龄、性别和基因型）识别出13种与表型转换风险增加相关的蛋白（如NEFL、DUSP29、CALCB等）。LASSO惩罚模型进一步筛选出7种蛋白（包括NEFL），其风险评分在Kaplan-Meier分析中显示出显著的分层能力（高风险组中位无转换生存期3.1年 vs 低风险组12.3年）。
- **表型转换事件预测**：基于137种差异蛋白，采用逻辑回归（LR）结合五折交叉验证，构建了不同时间窗口（0.5、1、2、3、5年）的预测模型。最优模型包含的蛋白数量从11到34种不等，AUC在0.897至0.963之间。通过数据驱动结合专家筛选，最终确定19种蛋白的核心组（包括NEFL、DUSP29、CALCA等），其预测性能优于单独使用NEFL（例如，1年预测AUC 0.963 vs NEFL 0.82）。敏感性分析显示，19蛋白组在不同时间窗口的灵敏度和特异度分别为76%–95%和76%–95%。
- **表型转换时间估计**：利用截断回归模型，基于19蛋白组估计表型转换时间，预测值与实际值的相关系数为0.79，平均绝对误差（MAE）为1.62年，显著优于单独使用NEFL（MAE 2.37年）。15蛋白子集（用于UK Biobank验证）表现相似（MAE 1.72年）。
- **UK Biobank验证**：在UK Biobank数据中，通过比较表型转换者与年龄/性别匹配对照，重复了NEFL、EDA2R、CA3等7种蛋白的伪纵向轨迹模式。15蛋白验证组在估计表型转换时间方面表现最佳（MAE 2.75年），优于10蛋白组（MAE 2.90年）和单独NEFL（MAE 3.61年）。尽管UK Biobank数据为横截面且表型转换时间基于住院编码近似，结果仍提供了定性支持。

**讨论与结论**
讨论部分指出，这是首次系统描绘从症状前到临床显性ALS的蛋白质生物标志物纵向轨迹，利用最大的表型转换者队列（已知精确转换时间）揭示92种蛋白在转换前偏离对照，19蛋白组可在0.5至5年时间窗口内预测表型转换事件（AUC 0.80–0.89），并估计转换时间（MAE 1.6年）。研究强调，多蛋白组优于单独NEFL，尤其在非快速进展型致病变异携带者中。研究结论部分翻译如下：这项研究首次描绘了从症状前到临床显性阶段的ALS蛋白质生物标志物纵向轨迹，识别出19种蛋白组成的核心组，可预测表型转换事件并估计转换时间，为ALS预防试验的受试者筛选和终点评估提供了关键工具，推动了ALS预防的最终目标。