《Plants》：Progress, Challenges, and Standardization Pathways in the Isolation and Purification Techniques of Plant-Derived Vesicles
植物来源囊泡（Plant-Derived Vesicles，PDVs）是天然的生物活性纳米结构和潜在载体，在生物治疗和药物递送方面具有重要应用前景。然而，它们的分离纯化技术面临诸多挑战，包括植物细胞壁的物理屏障和次生代谢物的干扰。这使得现有技术难以同时实现规模化生产和高纯度。本综述从六个维度评估主流分离方法：操作难度、成本、通量、纯度、产量和对囊泡完整性的影响。此外，还提出了一种基于植物器官的分离策略。进一步，本综述探讨了植物外泌体的标准化表征和质量控制策略，旨在为该领域的研究提供标准化且可操作的技术框架。未来的研究需要标准化生产、稳健的质量控制框架以及明确的作用机制阐明，以促进PDVs的临床应用。
**1. Introduction**
**1.1. PDVs and Research Progress**
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是细胞释放的脂质双层包裹颗粒，直径约40–1000 nm，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。几乎所有活细胞（包括植物、动物和微生物）都能分泌EVs，通过运输蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子介导细胞间通讯。外泌体是研究最广泛的EVs亚型，在疾病诊断、药物递送和再生医学中具有潜力。动物外泌体研究始于1980年代，1983年Johnstone团队首次在羊网织红细胞培养上清中观察到约50 nm的囊泡结构，1987年正式命名为“外泌体”。Valadi等发现外泌体携带功能性mRNA和miRNA，可被受体细胞摄取并调控靶基因表达，凸显了其在细胞间信息传递中的关键作用。植物细胞也被证实分泌与动物外泌体形态和生物发生相似的细胞外囊泡，常称为类外泌体纳米颗粒（Exosome-Like Nanoparticles，ELNs）。由于缺乏统一定义和命名标准，本文统称为植物来源囊泡（Plant-Derived Vesicles，PDVs）。PDVs于1965年首次在胡萝卜细胞中观察到，称为“次级囊泡”，但受限于细胞壁物理屏障和分子标记缺乏，研究长期受限。2008年和2009年分别从番茄细胞和向日葵分泌物中成功分离，2013年从葡萄汁中高效分离出直径50–300 nm的PDVs，因其高产量和生物活性引发广泛关注。随着分离技术进步，PDVs研究快速增长，尤其在疾病治疗领域。例如，柠檬汁中的纳米囊泡可通过激活TRAIL介导的凋亡抑制慢性髓系白血病肿瘤生长；人参来源的ELNs可减轻小鼠结肠炎症状；石榴来源的ELNs经口服后积累于肝脏，改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝。2025年6月，中国药品监督管理局将EVs纳入先进治疗药物监管框架，标志着该领域从基础研究向商业化转变。
**1.2. Compositional Characteristics, Structural Advantages, and Functional Applications of Plant Exosomes**
PDVs（也称ELNs）作为天然纳米载体，兼具生物活性和药物递送能力。与动物外泌体相比，PDVs具有低免疫原性、资源丰富和伦理问题少等优势。其内源性活性化合物表现出显著的药理活性，如抗肿瘤、免疫调节和维持肠道微生态平衡。PDVs具有磷脂双层结构，包裹蛋白质、RNA和小分子活性物质。脂质占30–50%，包括磷脂酰胆碱、磷脂酸和神经酰胺，决定其生物分布和细胞靶向性。例如，葡萄来源ELNs通过脂质成分靶向肠道干细胞激活Wnt/β-catenin通路；葡萄柚ELNs通过磷脂酰胆碱介导的肠-肝迁移实现靶向药物递送。蛋白质作为功能执行者，柑橘ELNs含跨膜转运蛋白，可增强药物跨肠屏障生物利用度。RNA成分（尤其是miRNA）在脂膜保护下具有跨物种基因调控潜力，如生姜ELNs中的aly-miR396a-5p可抑制SARS-CoV-2复制。小分子（如黄酮类和花青素）虽含量低，但协同增强疗效，如草莓ELNs保护细胞免受氧化损伤。
**1.3. Technical Bottlenecks and Research Significance of PDVs**
PDVs在生物医学领域展现广阔前景，但临床转化面临分离纯化技术瓶颈。主要问题是现有方法难以同时实现高产量和高纯度。植物细胞壁的复杂结构和次生代谢物（如多酚和多糖）的干扰限制了PDVs的分离。超速离心（Ultracentrifugation，UC）导致囊泡聚集和损失，聚合物沉淀法纯度不足且回收率低。由于PDVs来源多样（如果肉、根、种子、汁液、根茎和干燥药材），难以开发统一的标准化分离纯化方案，阻碍了研究可重复性和临床转化。尽管国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）的MISEV2018指南提供了EV研究基本框架，但仍需针对植物外泌体的特定解决方案。近两年综述主要关注下游功能分析，而作为基础的上游分离纯化技术常被略述。本文从六个实践维度系统评估主流分离纯化技术，并基于不同植物器官的生理特性提出创新性器官导向分离策略，为植物外泌体分离纯化工具箱提供使用指南。
**2. Overview of PDV Separation and Purification Technology**
**2.1. Traditional Separation Technology**
**2.1.1. Differential Ultracentrifugation and Density Gradient Centrifugation**
差速超速离心（Differential Ultracentrifugation，DUC）是目前最常用的PDVs分离技术，基于粒子沉降系数差异，先低速离心去除细胞碎片，再高速离心（40,000–100,000× g）沉淀PDVs。操作简单、生物相容性高，但提取效率低，依赖于高精度设备。植物细胞壁结构和次生代谢物影响PDVs物理性质，导致粒径分布、产量和纯度差异较大。研究人员建议优化离心时间、相对离心力和温度以开发种属特异性方案。多次离心易造成外泌体结构损伤，添加高密度等渗缓冲层（如蔗糖垫）可保护结构，间歇离心策略可提高沉淀效率。为提升纯度，DUC常与密度梯度离心（Density Gradient Centrifugation，DGC）联用，通过构建下降密度梯度（如蔗糖、碘克沙醇或氯化铯）实现精确分离。DGC在解析复杂样品（如去除共沉淀病毒颗粒）方面优于DUC，分离效率高且变形小，但梯度介质可能影响后续实验。
**2.1.2. Polymer Precipitation Method**
聚合物沉淀法因操作简便、产量高而受关注，常用聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）降低PDVs溶解度使其沉淀。研究表明，PEG沉淀的囊泡（如生姜来源）具有与DUC相似的回收率和生化特性。除PEG外，鱼精蛋白和醋酸钠也可沉淀带电荷EVs，但存在共沉淀污染蛋白的问题。Savci等优化了PEG/地塞米松两相系统分离葡萄柚汁中PDVs，提高了杂质去除和纯度。但植物多糖干扰仍存在挑战。沉淀法很少单独使用，多数研究添加额外纯化步骤。近期通过pH调节和调控EVs表面电荷，显著提高了提取效率，如酸性条件下生姜PDVs产量提高五倍。
**2.1.3. Size Exclusion Chromatography**
尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography，SEC）基于粒子流体动力学半径差异，将EVs与可溶性蛋白和蛋白聚集体等小分子杂质分离。SEC操作简便、可避免共分离污染物、可规模化，分离的PDVs纯度高且保留囊泡结构和生物活性成分，适合后续组学分析和功能研究。从卷心菜汁中提取PDVs时，SEC相比超滤（Ultrafiltration，UF）、PEG沉淀和DUC，获得的纳米囊泡纯度更高，粒径分布更均匀。但SEC面临细胞壁来源多糖（如果胶和纤维素）导致柱堵塞的问题，通常采用酶解、UF或亲和色谱预处理，或使用亲水改性柱。SEC处理时间较长，常作为精制步骤与UC或UF联用，以提高通量并减少多糖堵塞。
**2.2. Emerging Separation Technologies**
**2.2.1. Specific Purpose-Oriented Technology Immunoaffinity Method**
免疫亲和分离技术依赖特异性抗原-抗体相互作用，靶向囊泡表面标志物实现高纯度分离。操作简单，单周期2–4 h内完成。由于植物外泌体缺乏明确特异性表面标志物，其应用受限。植物与动物外泌体蛋白质组差异显著，哺乳动物标志物不适用。Huang等利用拟南芥中TET8蛋白EC2结构域抗体成功纯化TET8阳性外泌体亚型，但缺乏广泛保守标志物限制了通用性。该方法更适用于精确鉴定而非大规模制备，未来解决标志物和抗体挑战后可开发高纯度治疗性ELNs。
**2.2.2. Improved Traditional Technologies**
**Microfluidics**
微流控技术利用芯片上的微尺度通道和腔室，基于粒径、电荷和化学相互作用精确分离外泌体，具有高通量和自动化潜力。Li等设计微流控芯片，通过多个过滤腔室分级提取不同尺寸的植物外泌体，减少对离心机的依赖，缩短实验周期，显著提高提取效率。
**Field Flow Fractionation**
场流分离（Field Flow Fractionation，FFF）是一种无固定相分离技术，在扁平通道中施加垂直于流动方向的外力场，使不同粒径和分子量的组分因迁移速率差异而分离。FFF无固定相、系统压力低、剪切效应小，分离过程对植物ELNs结构和活性干扰最小。Wu等优化了非对称流场流分离（Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation，AF4）的核心参数，突破EVs与脂蛋白分离的技术瓶颈，获得高纯度、高重复性和高质量外泌体，解决了脂蛋白污染、机械破坏囊泡完整性及组学结果准确性问题。
**3. Methodological Performance Evaluation and Plant Organ-Directed Isolation Strategies**
**3.1. Methodological Performance Evaluation Model Based on Six Criteria**
ISEV建议根据应用需求选择EV分离方法，将目标分为四类：高回收率低特异性、中等回收率中等特异性、低回收率高特异性、高回收率高特异性。本文基于操作难度、成本、通量、纯度、产量和对囊泡完整性的影响六个维度，系统评估主流分离方法，反映方法可行性、分离性能、可扩展性和囊泡完整性保持。评估分数基于代表性研究和文献的文献半定量评分法给出。研究人员可根据研究目标对不同维度赋权选择合适方法，该框架提供比较性指导而非绝对定量标准。
**3.2. Plant Organ-Oriented Separation Strategies**
植物器官的细胞结构、代谢物组成和理化性质差异显著，需采取定制化分离策略。本文系统阐述了叶片、果实、花、茎和根等器官的优化分离方案。
**3.2.1. Sample Preparation Before PDVs Isolation**
正式分离前，适当的样品制备至关重要。机械破碎（如研磨、挤压或搅拌）是最基本的方法，用于释放含囊泡液体。不同提取策略可能影响植物汁液化学成分和生物活性，进而影响PDVs产量、组成和活性。预处理策略应根据源材料特性优化，如柑橘汁中添加Tris-HCl去除共纯化果胶，纤维素酶处理纤维素丰富的植物组织可提高芦荟细胞外囊泡回收率和纯度，产生更均一的粒径分布。除常规榨汁，真空渗透收集的质外体洗涤液可用于低汁液组织，植物悬浮培养细胞和愈伤组织也成为替代来源。未来需开发更温和、标准化和可重复的样品制备策略。
**3.2.2. Leaves**
普通结构叶片适合DUC，可有效去除叶绿体碎片等大颗粒杂质并初步富集囊泡。特殊结构叶片（如夹竹桃科植物）的多层表皮、厚角质层、高果胶含量和乳汁管形成物理屏障，Ou等提出酶处理（如果胶酶和纤维素酶）结合DUC的策略，有效解构细胞壁网络，提高囊泡产量。需更高纯度时，DGC可提供更纯产品但产量低、时间长；UF结合SEC可有效去除污染物并保持良好产量，是获得高均一性叶片来源囊泡的可靠方法。
**3.2.3. Fruits**
果实组织按理化性质分为低黏度低糖水果和高黏度高糖水果。低黏度低糖水果常用DUC，简便且成本低。高果胶水果（如蓝莓）中，果胶在UC高速离心力下易与囊泡形成凝胶复合物，Iriawati等建议用果胶酶预处理破坏凝胶网络，再用PEG富集。高游离糖组织（如石榴）中高渗透压导致囊泡结构塌陷，采用切向流超滤结合SEC可缓解渗透压，保持囊泡完整性和功能活性。
**3.2.4. Flowers**
花组织中多糖、非外泌体囊泡和丰富色素阻碍外泌体分离。DUC作为初步纯化步骤，蔗糖DGC基于密度差异更精确分离，有效去除共纯化污染物。Li等从金银花干花中分离纳米囊泡，经磷酸盐缓冲液浸泡、匀浆、重复离心澄清后，采用中空纤维切向流过滤（200 nm孔径，750 kDa MWCO）分离≤200 nm囊泡，获得窄粒径分布、负zeta电位和稳定形态的纳米囊泡，在模拟胃肠液中保持完整性和功能性，适合口服。
**3.2.5. Stems**
植物茎的外泌体研究主要集中于变态茎，如根茎（生姜、姜黄）、块茎（山药、马铃薯）和鳞茎（洋葱、大蒜）。这些器官富含淀粉、蛋白质、多糖和黄酮类，黏度高且杂质多。DUC结合蔗糖DGC在保留活性成分方面具有独特优势。
**3.2.6. Roots**
根组织成分复杂，细胞排列紧密，含大量淀粉粒和次生代谢物，大小与外泌体相似。DUC结合蔗糖DGC可有效去除大颗粒杂质和细胞碎片，基于密度差异分离与囊泡大小相似的杂质（如小淀粉粒和线粒体碎片），收集高质量纯外泌体材料。
**4. Quality Control and Standardized Characterization of PDVs**
**4.1. Physical Characterization**
物理表征是PDVs鉴定和质量评估的第一步，关键参数包括粒径分布、颗粒浓度、形态和表面电荷，与植物细胞类型、生长阶段生理及提取纯化效率相关。
**4.1.1. Particle Size Distribution and Concentration**
粒径分布是区分不同EV亚群的主要参数，与分子组成和生物功能相关。颗粒浓度提供定量测量，用于体外和体内实验剂量确定。动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）和纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）是常用技术。DLS基于布朗运动引起的散射光强度波动，提供强度加权平均粒径（Z-average）和多分散指数（Polydispersity Index，PDI），快速评估平均粒径和均匀性，但对异质样本或聚集物会高估粒径。NTA追踪单个粒子布朗运动，提供粒径分布和绝对浓度，分辨率高，适合多分散体系。建议联合使用DLS和NTA以确保准确分析。
**4.1.2. Morphology**
形态表征提供直接证据，PDVs常呈杯状或碟形。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）广泛用于可视化纳米尺度形态、大小和膜完整性，但常规制备可能引起形变，植物多糖可能产生“多糖伪影”。冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy，Cryo-EM）通过快速冷冻保持天然水合状态，提供更准确的结构信息，减少脱水固定导致的变形。原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）提供三维表面形貌和力学性质（如膜刚度、刚性和弹性），无需大量样品制备，有助于研究囊泡稳定性和与受体细胞的相互作用。
**4.1.3. Surface Charge**
表面电荷是PDVs胶体稳定性的重要指标，zeta电位反映囊泡间静电排斥力，防止聚集。植物来源囊泡的zeta电位范围从近中性到约?50 mV。绝对值越高，胶体稳定性越好。电泳光散射是常用分析技术，通过测量带电囊泡在电场中的电泳迁移率确定zeta电位，用于评估PDVs制备的稳定性和质量。
**4.2. Component Analysis and Functional Activity Evaluation**
**4.2.1. Component Analysis of PDVs**
PDVs包含核酸、蛋白质和植物来源小分子，需系统分析以阐明活性分子基础并确保安全性。
**Nucleic Acid Analysis**：PDVs富含miRNA、mRNA和lncRNA等RNA货物，miRNA可通过跨物种转移调控宿主基因表达，产生抗炎、抗病毒和抗纤维化作用。高通量测序（如小RNA测序、RNA测序）全面表征RNA货物，定量实时PCR和微滴数字PCR用于敏感检测和准确定量。
**Protein Analysis**：蛋白质在囊泡形成、膜稳定性、细胞识别和生物调控中起重要作用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）提供蛋白质分布概览，质谱（Mass Spectrometry，MS）蛋白质组学方法基于肽段特征鉴定和定量蛋白质，系统分析蛋白质组成，发现参与囊泡稳定、细胞摄取和靶向的功能蛋白。
**Metabolite Analysis**：植物特异性代谢物（如人参皂苷、姜辣素和β-谷甾醇）是PDVs独特成分，贡献治疗效应。液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）广泛用于鉴定和定量代谢物，基于色谱分离、质荷比和碎片模式提供代谢物组成和丰度信息，有助于识别生物活性分子并阐明其贡献。
**4.2.2. Functional Activity Evaluation**
功能验证连接成分分析与生物应用。通过设计体外或体内模型，结合相关功能和分子指标评估PDVs生物活性。例如，Li等定量鉴定人参来源ELNs中26种人参皂苷后，进一步在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中监测NO、TNF-α和IL-6等炎症介质表达水平，验证其抗炎作用。
**5. Challenges and Future Perspectives**
PDVs从有前景的生物实体向临床治疗药物转化面临复杂挑战。主要挑战在于建立稳健且可规模化制造工艺，当前分离技术（如传统UC、免疫亲和法等）始终面临产量与纯度之间的基本权衡。未来需应用微流控和先进过滤等新型工程解决方案实现大规模生产和可重复性。同时，需加深对PDVs生物学的理解，当前缺乏通用或组织特异性生物标志物严重阻碍准确鉴定和功能分析，应建立整合脂质组学、蛋白质组学和转录组学的系统多组学框架，解码PDVs完整组成谱。此外，缺乏标准化技术评估生物效力和确定剂量，不同研究有效剂量差异大，阻碍比较和临床转化。最后，加强跨学科合作至关重要：多组学技术与生物信息学协同可系统表征PDVs全谱，利用先进算法构建详细数据库；化学工程和材料科学可开发新型分离材料和工艺，提高回收率和纯度，并设计创新递送系统增强体内稳定性和靶向性；人工智能（Artificial Intelligence，AI）和自动化技术可优化提取参数、预测生物活性并实现全流程自动化，提高研究效率和结果可重复性。跨学科合作是推动PDVs研究新时代的关键，将科学发现高效转化为临床实践，为疾病治疗提供新希望。总之，PDVs临床采用的道路虽具挑战，但已明确。专注于标准化制造、阐明生物学机制和建立功效驱动评估框架，将把PDVs从科学好奇心转变为新型实用临床治疗剂，最终实现其解决未满足医疗需求的潜力。
