ALFAssay: 基于定量片段组学的乳腺癌ctDNA分析的前馈神经网络

《PLOS Computational Biology》：ALFAssay: A feed?forward neural network for quantitative fragmentomics?based ctDNA profiling in breast cancer

　　

细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的分析正在改变癌症诊断，但在低拷贝数变异（copy-number aberration，CNA）负荷的肿瘤中，通过浅层全基因组测序（shallow whole-genome sequencing，sWGS）来量化循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）的比例仍然具有挑战性。研究人员引入了ALFAssay，这是一种前馈神经网络，可通过cfDNA的片段化图谱来估算乳腺癌中的ctDNA比例。研究人员使用了来自896份血浆样本的cfDNA，这些样本涵盖了早期和转移性HR+/HER2-以及三阴性乳腺癌，以及健康对照组，（ID：NCT03616886，NCT02028364，NCT03065621），通过计算5 Mb基因组窗口内短片段（90–150 bp）与所有读长的比率，同时通过将每个bin的总读长数作为额外输入特征来考虑覆盖效应，研究人员提取了204个bin级别的片段化特征。得到的408维向量被输入到一个全连接网络中，该网络使用五折交叉验证对ichorCNA衍生的ctDNA比例进行训练。ALFAssay在ctDNA检测中表现出高灵敏度（0.87）和特异性（0.94），并且与ichorCNA（r = 0.89）和基于片段化的工具Fragle（r = 0.81）相关。其ctDNA预测结果可根据无进展生存期对患者进行分层，并为现有工具增加互补的预后价值。因此，ALFAssay扩展了用于ctDNA量化的生物信息学工具包，并凸显了片段化特征在增强多模态液体活检工作流程中的潜力。

**ALFAssay: 基于定量片段组学的乳腺癌ctDNA分析的前馈神经网络——论文解读**

**研究背景、问题与意义**

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的分析为非侵入性癌症监测带来了革命性变化，能提供关于肿瘤负荷、治疗反应和疾病进展的关键信息。然而，从细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）池中精确量化ctDNA比例在技术上仍具挑战，尤其是在肿瘤负荷低或基因组变异微小的情况下。传统方法，如用于突变追踪的靶向深度测序和用于拷贝数变异（copy number aberration，CNA）分析的浅层全基因组测序（shallow whole-genome sequencing，sWGS），已被广泛用于推断ctDNA的存在。像ichorCNA这样的工具已证明通过CNA分析能有效检测多种癌症类型的ctDNA，但它们在低CNA负荷的肿瘤中灵敏度会降低，这一局限性在激素受体阳性/HER2阴性（HR+/HER2-）乳腺癌中尤为明显，因为其基因组异常通常比三阴性乳腺癌等更具侵袭性的亚型更少。

为应对这些限制，近年研究转向利用cfDNA的替代特征——尤其是片段化模式——作为基于拷贝数方法的补充信号。累积证据表明，源自肿瘤细胞和非肿瘤细胞的cfDNA片段表现出不同特征，癌症患者展现出改变的片段大小分布和非随机切割图谱。这些片段化特征由肿瘤细胞与健康细胞之间染色质组织、核小体定位和降解动力学的差异所塑造。深度学习模型已被开发用于从这些片段组学（fragmentomic）图谱中量化肿瘤比例。例如，Fragle使用卷积神经网络通过片段大小分布估算肿瘤比例；类似地，iLLMAC是一种基于指令调整的大型语言模型，用于通过cfDNA末端基序图谱检测癌症。本研究中，研究人员引入了ALFAssay，这是一个专门为乳腺癌定制的深度学习模型，它利用cfDNA片段化模式估算肿瘤比例。该模型在通过ichorCNA估算肿瘤比例的数据集上进行训练，学习提取有意义的基于片段化的ctDNA表征。与传统的聚焦于CNA的工具（如ichorCNA）不同，该模型旨在利用片段化信号，并针对乳腺癌应用进行了优化。通过全面评估，研究人员证明ALFAssay为现有ctDNA定量方法提供了补充，扩展了微创癌症诊断的工具包。该论文发表在《PLOS Computational Biology》。

**主要关键技术方法**

研究人员开发了ALFAssay，一个前馈神经网络（feed-forward neural network，FFNN）模型。关键技术方法包括：1）特征提取：将基因组划分为204个5 Mb非重叠bin，计算每个bin内短cfDNA片段（90–150 bp）与所有片段（30–700 bp）的比率，并结合每个bin的总片段计数作为输入特征，形成408维向量。2）模型架构：采用一个包含四个全连接隐藏层（使用ReLU激活函数和层归一化）和最终线性输出单元的全连接前馈神经网络，进行回归任务以预测肿瘤比例。3）训练与验证：模型训练使用来自Neorhea（早期HR+/HER2-乳腺癌，98名患者，267个样本）和Synergy（转移性三阴性乳腺癌，127名患者，344个样本）队列以及部分健康对照（98名健康女性，148个样本）的共896份血浆样本的sWGS数据，采用五折交叉验证，并以ichorCNA导出的大于等于3%的肿瘤比例作为参考标签。独立验证使用Pearl队列（转移性HR+/HER2-乳腺癌，48名患者，132个样本）和其余健康对照样本。4）比较分析：将ALFAssay与基于片段化的工具Fragle、LASSO回归模型以及一个复合模型（ALFAssay+Fragle）进行比较，评估标准包括与ichorCNA、基于突变的OncoFollow检测的ctDNA检测结果的一致性，以及基于无进展生存期（progression-free survival，PFS）的预后分层能力。

**研究结果**

**Overview of a neural network model for predicting ctDNA fraction from cfDNA**
研究人员开发了ALFAssay并通过详尽的流程设计证明了其预测能力。通过将基因组划分为204个5 Mb的bin，并计算每个bin内短片段比率与总片段计数，每个血浆样本被表示为408维特征向量。该模型是一个全连接前馈神经网络，通过五折交叉验证在Neorhea、Synergy队列及部分健康样本上进行训练，以ichorCNA导出的肿瘤比例（≥3%为阳性）作为参考标签。独立的Pearl队列和其余健康样本用于验证。结果表明，该流程能够有效处理cfDNA数据，并生成可用于后续预测的特征。

**ALFAssay ctDNA fraction prediction across breast cancer subtypes and disease stages**
ALFAssay在训练和验证数据集中均展现出区分不同临床状态的能力。在训练队列中，健康女性的预测ctDNA比例中位数极低，早期乳腺癌（Neorhea队列）患者预测比例较低，而转移性乳腺癌（Synergy队列）患者预测比例最高。在独立验证的Pearl队列中，模型同样区分了健康对照（预测值中位数为0）和转移性HR+/HER2-乳腺癌患者（预测值中位数为0.02）。与ichorCNA检测状态一致，ctDNA阳性样本的预测比例显著高于阴性样本。进一步与LASSO模型比较，在验证队列上，ALFAssay显示出略高的准确率（0.92 vs 0.90）和特异性（0.94 vs 0.92），但均未达到统计学显著性。在与Fragle、LASSO及复合模型（ALFAssay+Fragle）的对比中，基于ichorCNA和PFS（6个月为界）作为参考，ALFAssay及其复合模型表现相当，且优于Fragle和LASSO；基于OncoFollow作为参考，ALFAssay和LASSO表现相似，优于Fragle和复合模型。这些结果表明，ALFAssay能有效预测ctDNA比例，并与疾病进展状态相关。

**ALFAssay ctDNA fraction correlation with established tools**
ALFAssay的预测结果与现有工具显示出良好的一致性。在Pearl队列中，ALFAssay预测的肿瘤比例与ichorCNA结果高度相关（R = 0.89），与Fragle结果也高度相关（R = 0.81）。与基于突变的OncoFollow检测的变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）相关性较低（R = 0.58），提示两种方法可能互补。在ichorCNA检测为阴性的样本（ichorTF ≤ 0.03）子集中，ALFAssay在3个样本中预测了较高的ctDNA水平（≥0.03），其中2个样本也通过OncoFollow检测到可检测的突变VAF，所有3个样本都具有高Fragle ctDNA负荷，表明在部分ichorCNA阴性样本中，基于片段化的方法可能检测到拷贝数方法无法识别的ctDNA信号。

**Risk stratification analysis based on ctDNA fraction prediction**
ALFAssay的ctDNA预测具有预后价值。在Pearl验证队列中，根据ALFAssay预测的ctDNA水平将患者分为“未检测到”、“低”和“高”三组，Kaplan-Meier生存分析显示，较高的ctDNA水平与较短的无进展生存期（PFS）相关。在单变量Cox比例风险分析中，无论在基线还是治疗14天后（D14），ALFAssay单独或与其他方法（ichorCNA、Fragle、OncoFollow）组合，ctDNA阳性状态均与疾病进展风险显著增加相关。配对模型的似然比检验表明，在D14时间点，将ichorCNA加入ALFAssay或OncoFollow后，模型拟合度显著改善，提示这些方法在捕获治疗过程中的ctDNA动态变化方面具有互补性。

**总结讨论与结论翻译**

本研究提出了ALFAssay，一个利用cfDNA片段化模式估算乳腺癌患者肿瘤比例的深度学习模型，为低CNA负荷乳腺癌提供了基于片段化的ctDNA补充估计策略。该模型通过学习拷贝数衍生的肿瘤比例与cfDNA片段化模式之间的映射关系，将CNA信息转化为片段化模型。ALFAssay的训练和验证基于涵盖不同乳腺癌亚型和疾病阶段的896份血浆样本，展现出稳健性能。其设计通过GC校正、质量控制以及将总片段计数作为输入特征来减少技术偏差。与Fragle等工具相比，ALFAssay采用全连接架构和覆盖度校正的特征空间，平衡了预测能力和计算效率。在独立验证中，其AUC为0.96，特异性为0.94。ALFAssay在预后分层方面具有价值，其与ichorCNA、Fragle和OncoFollow的组合分析表明，不同方法捕捉到ctDNA信号的互补方面，组合使用可能提供更全面的预后信息。相关性分析进一步支持了模型间的互补性：ALFAssay与ichorCNA（R=0.89）和Fragle（R=0.81）强相关，但与基于突变的检测（R=0.58）相关性较弱。

**研究结论部分翻译：**
总之，ALFAssay通过引入一个应用于转移性乳腺癌的、基于片段化的深度学习模型，为日益增长的、用于从cfDNA进行肿瘤比例估算的生物信息学方法库做出了贡献。该模型包含了减少技术偏差的步骤，计算效率高，并显示出与其他基于片段化、CNA和突变的方法相媲美且可能互补的性能。这些特征表明其在多模式ctDNA监测策略中的潜在用途。尽管如此，还需要进一步的工作来使用正交方法校准肿瘤比例估算，并在更大、更多样化的队列中验证其性能，以确立其稳健性和临床相关性。