《IBRO Neuroscience Reports》：Mongolian Warm Acupuncture Improves Colonic Barrier Function and Immune Responses via the TLR4/MyD88/NF-κB Pathway in Insomnia Rats
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失眠是一种普遍存在的睡眠障碍，与肠道屏障功能障碍和免疫失调相关。蒙古温针灸（MWA）在失眠治疗中显示出潜力；然而，其对肠道通透性的影响及潜在机制仍不清楚。在本研究中，研究人员使用慢性不可预测轻度应激结合对氯苯丙氨酸（PCPA）建立了失眠大鼠模型。为评估MWA的
失眠是一种普遍存在的睡眠障碍，与肠道屏障功能障碍和免疫失调相关。蒙古温针灸（MWA）在失眠治疗中显示出潜力；然而，其对肠道通透性的影响及潜在机制仍不清楚。在本研究中，研究人员使用慢性不可预测轻度应激结合对氯苯丙氨酸（PCPA）建立了失眠大鼠模型。为评估MWA的治疗效果，研究人员在包括对照组、模型组、MWA组、艾司唑仑组和假MWA组在内的不同组间进行了比较分析。MWA组在睡眠质量、认知表现和焦虑样行为方面显著改善，并减轻了结肠组织损伤。MWA治疗通过调节ZO-1、Occludin和Claudin-4的表达减轻了肠道屏障功能障碍。此外，MWA通过降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平并增加IL-22表达来减少炎症反应。此外，MWA抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。这些发现表明，MWA对失眠相关的肠道屏障功能障碍和炎症发挥保护作用，并可能代表一种有前景的非药物失眠治疗策略。
失眠是一种以入睡或维持睡眠困难为特征的常见睡眠障碍，全球约10%–30%的人群受其影响，并与神经免疫和代谢失调相关。长期睡眠不足增加精神、心血管及代谢疾病风险。当前临床主要依赖苯二氮卓类和非苯二氮卓类催眠药，但长期使用存在耐受、依赖、认知损害等副作用，亟需安全有效的替代疗法。既往研究表明，肠道屏障功能障碍与睡眠障碍密切相关，屏障破坏可导致微生物分子和内毒素易位，触发全身及神经炎症反应，其中Toll样受体4（TLR4）介导的信号通路（包括MyD88和核因子κB（NF-κB））发挥关键作用。蒙古温针灸（MWA）是蒙医传统疗法，通过机械和热刺激特定穴位调节生理功能，已在失眠模型中显示调节微小RNA表达和血清代谢物谱的潜力，但对其肠道通透性和免疫功能的调控机制尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明MWA通过TLR4/MyD88/NF-κB通路对失眠大鼠结肠屏障功能和免疫反应的保护作用。论文发表在《IBRO Neuroscience Reports》。
研究人员为开展研究使用了以下关键方法：从SPF（北京）生物技术有限公司购得50只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重180–220 g）。采用慢性不可预测轻度应激（CUMS）联合对氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射建立失眠模型，大鼠随机分为对照组、模型组、MWA组、艾司唑仑组和假MWA组（SMWA）。主要技术包括：戊巴比妥钠诱导睡眠实验评估睡眠潜伏期和持续时间；Morris水迷宫测试评估空间学习和记忆能力；旷场实验评估自发活动和焦虑样行为；苏木精-伊红（H&E）染色观察结肠组织病理学变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-22水平；Western blot和实时定量PCR（RT-qPCR）检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4及TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白和mRNA表达。
研究结果包括以下五个部分：
**3.1 MWA treatment improves sleep and cognitive function in insomnia rats**
通过戊巴比妥钠诱导睡眠实验、Morris水迷宫和旷场实验发现，与模型组相比，MWA组睡眠潜伏期显著缩短、睡眠时间延长；Morris水迷宫中总游泳距离和逃避潜伏期减少，平台穿越次数增加，目标象限停留时间延长，首次平台穿越潜伏期缩短；旷场实验中直立次数和总运动距离减少，不动时间增加。表明MWA显著改善失眠大鼠的睡眠质量、空间学习记忆和焦虑样行为，效果与艾司唑仑组相当，而假MWA组无显著改善。
**3.2 MWA reduce histopathological damage in colon of insomnia rats**
通过粪便布里斯托尔评分和H&E染色结肠组织观察，模型组大鼠粪便量减少、干硬、颜色变浅，布里斯托尔评分升高；结肠黏膜结构破坏、黏膜厚度减少、隐窝深度增加，伴有炎性细胞浸润。MWA组和艾司唑仑组治疗后粪便评分恢复至对照水平，结肠黏膜厚度增加、隐窝深度减少，组织损伤明显减轻，而假MWA组变化轻微。
**3.3 MWA improves colonic barrier function in insomnia rats**
通过Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-4的表达，模型组蛋白和mRNA水平均显著高于对照组。MWA和艾司唑仑治疗后上述表达显著降低，接近对照水平，而假MWA组无显著变化。表明MWA可调节紧密连接蛋白表达，改善失眠引起的结肠屏障功能障碍。
**3.4 MWA improves colonic inflammatory responses in insomnia rats**
通过ELISA和RT-qPCR检测炎症因子，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，IL-22水平显著降低。MWA和艾司唑仑治疗显著逆转上述变化，即降低促炎因子并升高IL-22，而假MWA组无显著差异。表明MWA可减轻结肠炎症反应，促进黏膜免疫保护。
**3.5 MWA regulates the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in insomnia rats**
通过Western blot和RT-qPCR检测TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达，模型组蛋白和mRNA水平均显著升高。MWA和艾司唑仑治疗显著抑制这些分子的表达，而假MWA组无显著变化。表明MWA通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎和屏障保护作用。
讨论部分总结：本研究证实MWA可显著改善失眠大鼠的睡眠行为、结肠形态、屏障完整性、炎症反应及TLR4/MyD88/NF-κB信号激活。MWA的治疗效果与艾司唑仑相当，且优于假MWA，提示其作用具有特异性。MWA可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路调控肠道免疫信号，从而减轻失眠相关肠道屏障功能障碍和炎症。研究结论：研究人员的研究结果表明，MWA治疗可能通过调节肠道免疫信号通路减轻失眠相关的肠道屏障功能障碍和炎症反应，这为MWA在失眠治疗中的潜力提供了机制性证据。
