CLARI-O清晰成像：类器官模型细胞架构、相互作用与形态学观察的窗口

《Frontiers in Neuroscience》：Seeing clearly with CLARI-O: a window into cellular architecture, interactions, and morphology of organoid models

　　

摘要：皮质类器官（cortical organoids，COs）代表了一种强大的体外模型系统，可重现人类大脑发育的关键方面，从而能够在生理相关的三维（3D）环境中研究神经发育过程、细胞多样性和疾病机制。然而，对COs的传统组织学分析依赖于组织切片，这限制了捕捉类器官架构完整空间复杂性的能力。在本研究中，研究人员建立了一个框架，将CLARI-O（一种改进的组织透明技术）应用于完整的COs及基于类器官的系统，从而实现对3D组织特征的全面3D可视化与分析。通过将CLARI-O与高分辨率成像相结合，研究人员证明了组织透明技术在研究胶质细胞群体（包括少突胶质细胞和小胶质细胞，这些细胞被认为在COs中代表性不足）及其与神经元相互作用方面的实用性。此外，研究人员将该方法应用于前脑组装体（forebrain assembloids，FAs），以可视化细胞异质性和腹侧与背侧区域之间的界面。最后，研究人员利用CLARI-O研究含有异种移植COs（MB-COs）的小鼠大脑，以评估人类细胞的整合、迁移、血管化和结构连接性。这是第一项证明在功能性检测（如钙成像）后可使用组织透明技术来关联MB-COs中神经活动与事后结构分析的研究。综上所述，这项工作确立了CLARI-O作为推进人类CO衍生系统3D结构与功能研究的有力工具，增强了其在疾病建模、药物筛选和转化神经科学中的价值。

**CLARI-O：揭示类器官三维结构与功能整合的透明成像平台——论文解读**

**1. 研究背景与问题**
传统二维（2D）细胞培养缺乏组织空间复杂性，无法模拟真实细胞相互作用。人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的皮质类器官（COs）能重现人类大脑发育的关键特征，是研究神经发育、细胞多样性和疾病机制的重要三维（3D）模型。然而，当前对COs的形态学分析仍依赖组织切片免疫组化，这只能提供有限二维视角，破坏了3D神经网络、长程连接和复杂内部结构，同时切片过程会切断轴突投射和细胞突起，导致信息丢失。此外，抗体渗透性不足和切片损伤也影响染色效果。这些限制制约了充分利用COs和异种移植小鼠脑（MB-COs）的复杂细胞结构。因此，亟需一种无需切片的完整类器官成像平台。

**2. 研究内容与结论**
为克服上述局限，研究人员优化了此前发表的2019年组织透明方法，开发了类器官特异性透明方案——CLARI-O。该方案整合低速离心和持续加热辅助被动透明，适用于COs、前脑组装体（FAs）和MB-COs。实验表明，CLARI-O能在15天内使COs和FAs达到光学透明，24天内使MB-COs透明，并保持内源性荧光蛋白信号。利用CLARI-O结合高分辨率共聚焦和双光子显微镜，研究人员实现了对完整类器官中神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞的高分辨率3D可视化，揭示了细胞间空间相互作用、轴突-胶质细胞接触、前脑组装体融合界面GFAP⁺胶质桥结构以及异种移植后人类细胞在宿主脑内的迁移、成熟和血管化过程。这是首次证明组织透明技术可在功能性钙成像后用于关联神经活动与事后结构分析。该研究还比较了CLARI-O与现有透明方法（如CLARITY、PACT、CUBIC、ScaleS4、3DISCO）的优劣，表明CLARI-O在脂质清除、荧光保存、抗体渗透和类器官/异种移植兼容性方面取得良好平衡。该成果发表在《Frontiers in Neuroscience》上，为疾病建模、药物筛选和转化神经科学提供了有力工具。

**3. 关键技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：
- 基于SDS（十二烷基硫酸钠）的被动透明技术，结合37°C加热辅助和低速离心（230×g或1700×g）促进脂质清除和试剂渗透。
- 免疫荧光染色：使用一抗（如抗GFAP、抗MAP2、抗MBP、抗Iba1、抗PSD95、抗Synaptophysin等）和对应二抗进行7天孵育，配合离心辅助抗体渗透。
- 折射率匹配：将样本置于80%甘油中平衡≥12小时，以实现光学均匀性。
- 成像系统：共聚焦显微镜（Leica SP8）和双光子显微镜（Bruker Ultima），使用水浸物镜和深Z轴堆叠采集。
- 样本来源：人iPSC系（WC-24-02-DS-B女性正常核型系和MGH2046系，由Steven J. Haggarty博士提供）；小鼠为NOD/SCID免疫缺陷小鼠（12-20周龄，Charles River Laboratories）。
- 功能性检测：术前使用LV-EF1α-mScarlet和LV-hSyn1-GCaMP8s标记COs，进行在体钙成像，随后对MB-COs进行CLARI-O处理。

**4. 研究结果**
**3.1 CLARI-O enables rapid clearing and 3D imaging of intact COs and MB-COs**
通过优化被动透明流程（增加离心步骤、维持37°C恒温），研究人员在15天内使COs和FAs透明，24天内使MB-COs透明。利用80%甘油匹配折射率后，共聚焦成像成功显示完整第120天CO中NF-H⁺轴突和GFAP⁺星形胶质细胞的3D空间分布，证实了CLARI-O对组织完整性的保护。

**3.2 Visualization of cellular heterogeneity in COs using CLARI-O**
对第150天含少突胶质细胞的COs（dOCOs）进行MAP2、NeuN和MBP染色，3D重建显示MBP⁺少突胶质细胞呈离散斑块状分布，推测源于胶质前体细胞的克隆扩增。NF-H与MBP共染揭示少突胶质细胞突起直接包裹轴突（白色箭头指示），提示活跃髓鞘化。此外，将iPSC衍生的小胶质细胞（IBA1⁺）整合入COs后，CLARI-O成像显示小胶质细胞有效浸润，并与PSD95⁺突触结构共定位，表明其在突触监视中的作用。

**3.3 Section-free visualization of forebrain assembloid fusion and interneuron integration using CLARI-O**
对FAs（由背侧和腹侧类器官融合而成）进行NeuN和GFAP免疫染色，首次发现GFAP⁺平行纤维在dCO-vCO连接处形成支架结构，NeuN⁺神经元沿此支架迁移（白色箭头）。此外，观察到三种形态不同的星形胶质细胞亚群（密集网状、过渡型、星形放射状），反映成熟进程。GABA⁺中间神经元与Synaptophysin⁺突触囊泡共定位，表明抑制性神经元功能整合。

**3.4 Whole-brain clearing enables 3D visualization of xenograft maturation and integration within the mouse cortex**
将LV-EF1α-mScarlet标记的COs移植入小鼠后扣带回皮层，1个月后移植细胞局限在植入位点，形态幼稚；5个月后细胞广泛迁移至对侧半球，轴突分支复杂；8个月时部分细胞迁移至小脑。在体钙成像（GCaMP8s）显示，56天时神经元活动不同步，143天时出现同步化网络活动，伴随形态成熟。Lectin染色显示宿主血管密布于移植体内部，证明血管化对移植体存活和整合的关键作用。

**5. 讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，CLARI-O克服了传统切片破坏空间结构的局限，通过离心辅助和加热稳定被动透明实现了快速、均匀的脂质清除，并兼容内源性荧光和事后免疫染色。与现有方法比较，CLARI-O在透明度、荧光保存、抗体渗透和类器官/异种移植兼容性方面取得平衡，但处理时间较长、成像需强大计算资源。局限性包括样本量小、未进行定量形态学分析、单轮染色受限于荧光通道数、成像数据量大（单个CO约60GB，MB-CO约68GB）。未来可结合多轮染色和多重标记，并与电生理、光遗传等功能分析关联。
**研究结论翻译**：总之，我们的CLARI-O提供了一个稳健、可扩展、多功能且易于使用的平台，用于类器官、组装体和异种移植组织的高分辨率三维可视化，弥合了结构与功能之间的鸿沟，并为在下一代三维神经模型中探索疾病机制、测试药物效应和开发新治疗策略提供了宝贵资源。