双酚A通过铁死亡途径诱导耳毒性损伤：网络毒理学、RNA测序与实验验证的综合分析

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Bisphenol A induces ototoxic injury by ferroptosis pathway: integrated analysis of network toxicology, RNA-sequencing and experimental validation

　　

双酚A（Bisphenol A）是一种全球广泛使用的塑料单体，已广泛渗透到水生和大气环境中，成为高度优先的环境污染物。然而，其对耳毒性损伤的毒理学影响及相关分子机制尚未得到充分探索。在本研究中，研究人员采用了一种整合网络毒理学（network toxicology）、RNA测序（RNA sequencing）和细胞表型分析的综合方法，系统阐明双酚A诱导损伤的途径。潜在的耳毒性相关靶点和双酚A结合蛋白来源于BindingDB、CTD、SwissTargetPrediction、TargetNet、DisGeNET和GeneCards等数据库，共鉴定出55个候选靶点。功能富集分析显示其显著参与自噬（autophagy）和HIF-1信号通路，而多算法拓扑分析确定了CASP3、PTGS2、CYCS、BCL2、TNF（肿瘤坏死因子）、PPARG、NFE2L2和MAPK3为关键枢纽蛋白。实验验证表明，双酚A以浓度依赖性方式降低细胞活力并增加乳酸脱氢酶（LDH）泄漏。RNA测序进一步揭示双酚A暴露后铁死亡（ferroptosis）通路显著激活。铁死亡细胞死亡进一步通过脂质活性氧（lipid ROS）、丙二醛（MDA）和细胞内Fe²⁺水平升高，以及GPX4、SLC3A2和FSP-1表达下调，ACSL4、PTGS2和HO-1表达上调得到证实。总的来说，研究人员的发现表明双酚A通过铁死亡通路诱导耳毒性损伤，提示这种环境污染物可能导致听力损失，并强调了针对双酚A暴露的潜在干预措施。

双酚A（Bisphenol A）是一种全球广泛使用的塑料单体，已渗透至水体和大气环境，成为高优先级环境污染物。以往研究多聚焦于药物导致的耳毒性（ototoxicity），如氨基糖苷类抗生素和顺铂，而环境污染物如双酚A对听觉系统的直接毒性机制尚不明确。流行病学横断面研究提示儿童双酚A暴露与听力下降存在关联，但分子机制未解。本研究旨在系统阐明双酚A诱导耳毒性损伤的分子通路及关键靶点。研究人员整合网络毒理学（network toxicology）、RNA测序（RNA sequencing）和细胞表型实验，在HEI-OC1耳蜗毛细胞系中验证了双酚A的毒性机制。结论表明，双酚A通过铁死亡（ferroptosis）通路引起耳蜗毛细胞死亡，从而抑制增殖并促进细胞死亡。该研究为双酚A暴露导致的听力损失提供了新的理论依据，并提示潜在干预靶点。论文发表在《Frontiers in Molecular Neuroscience》。

本研究采用的关键技术方法包括：①网络毒理学分析：从BindingDB、CTD、SwissTargetPrediction、TargetNet等数据库获取双酚A靶点，从DisGeNET和GeneCards获取耳毒性相关靶点，取交集后构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过MCODE和CytoHubba算法识别核心基因。②RNA测序：对双酚A处理后的HEI-OC1细胞（来源于BNCC）进行转录组测序，分析差异表达基因及通路富集。③细胞功能验证：使用CCK-8、LDH释放、集落形成测定细胞活力；C11-BODIPY 581/591探针检测脂质活性氧（lipid ROS）；FerroOrange检测细胞内Fe²⁺；Western blot检测铁死亡相关蛋白（GPX4、SLC3A2、FSP-1、ACSL4、PTGS2、HO-1）表达。

研究结果如下：

**1. 双酚A和耳毒性潜在靶点的获取及毒性预测**
通过数据库检索与毒性预测（ProTox 3.0），发现双酚A可模拟雌激素活性干扰钙信号，并直接破坏线粒体电化学梯度，导致早期氧化应激。从327个耳毒性相关基因和747个双酚A靶点中取交集，共获得55个候选靶点。

**2. 双酚A诱导耳毒性关键靶点和通路的鉴定**
对55个基因进行GO和KEGG富集分析，发现显著富集于内在凋亡信号通路、线粒体膜电位调节、谷胱甘肽代谢过程、对金属离子的响应等。多算法拓扑分析（MNC、MCC、Degree）识别出CASP3、PTGS2、CYCS、BCL2、TNF、PPARG、NFE2L2、MAPK3为核心枢纽蛋白，提示双酚A可能通过线粒体损伤和氧化应激触发耳毒性。

**3. 双酚A抑制HEI-OC1细胞活力**
CCK-8实验显示双酚A以浓度依赖性方式降低细胞活力，24h IC50为185.1μM，48h IC50为151.5μM。光镜观察见细胞密度下降和空泡化。集落形成实验证实25μM和50μM双酚A显著减少集落数。LDH释放实验显示48h暴露后，50、100、150μM双酚A组LDH活性显著升高，表明细胞膜损伤。

**4. RNA-seq揭示双酚A激活铁死亡通路**
RNA测序鉴定出3443个差异表达基因（2352个上调，1091个下调）。GO富集显示细胞过程、细胞解剖实体、催化活性显著富集。KEGG通路富集包括TNF信号、自噬、p53信号、FoxO信号及铁死亡通路。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1和Liproxstatin-1预处理可部分恢复双酚A处理后的细胞活力，证实铁死亡参与。

**5. 双酚A诱导铁死亡的实验验证**
C11-BODIPY 581/591探针显示双酚A处理后脂质ROS（氧化形式/还原形式比率）显著升高。MDA含量增加，表明脂质过氧化加剧。FerroOrange染色显示细胞内Fe²⁺水平明显升高。Western blot显示促铁死亡蛋白谱：GPX4、SLC3A2、FSP-1表达下调，ACSL4、PTGS2、HO-1表达上调，证实抗氧化系统受损、游离铁增加、脂质过氧化加速，驱动铁死亡。

讨论部分总结：双酚A通过雌激素样活性干扰钙信号，破坏线粒体膜电位，诱导早期氧化应激。其高亲脂性使其可穿过血脑屏障（BBB），在耳蜗积累并长期低剂量暴露。GO和KEGG富集结果与氧化应激和线粒体损伤一致。核心基因（CASP3、PTGS2等）参与脂质氧化、炎症和线粒体稳态。细胞实验显示双酚A抑制HEI-OC1增殖，浓度高于环境暴露水平，但有助于阐明急性/亚急性细胞反应机制。RNA-seq和功能验证共同证实铁死亡是双酚A诱导耳毒性的关键通路。本研究缺乏动物模型验证，未来需通过听觉脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）测试确认。

结论部分翻译：当前发现为双酚A诱导的耳毒性损伤的临床诊断和治疗提供了新的理论基础和策略框架。本研究证实双酚A通过启动耳蜗毛细胞的铁死亡来诱发耳毒性损伤，从而抑制增殖并促进细胞死亡。这些发现不仅阐明了双酚A诱导听觉损伤的机制并确定了潜在治疗靶点，而且为早期临床诊断和精准治疗奠定了理论基础。