综述：重写CAR-T细胞命运：CRISPR/Cas基因编辑用于实体瘤治疗

《Frontiers in Immunology》：Rewriting CAR-T cell fate: CRISPR/Cas gene editing for solid tumor therapy

　　

尽管嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但其在实体瘤中的治疗效果仍受到若干挑战的限制，包括肿瘤浸润不足、T细胞耗竭以及免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。CRISPR/Cas作为近年来发展的第三代基因编辑技术，具有简单和高效的特点。该技术已在多个领域显示出广泛的应用潜力，并已成为改善CAR-T细胞疗法的有力工具。在本综述中，研究人员总结了CRISPR/Cas基因编辑技术在增强CAR-T细胞抗实体瘤活性方面的最新进展。研究人员还讨论了当前面临的关键挑战，并系统地提出了克服这些限制的潜在策略。

**Challenges in CAR-T cell therapy against solid tumors**
尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但其在实体瘤（占所有癌症的90%以上）中的应用仍面临巨大挑战。实体瘤以血管化不足和富含细胞外基质（ECM）的肿瘤微环境（TME）为特征，这些共同构成了CAR-T细胞运输和浸润的物理屏障。因此，CAR-T细胞常无法有效从循环系统归巢至肿瘤部位，即使到达肿瘤周边，也可能无法穿透基质屏障进入肿瘤实质，从而限制其与肿瘤细胞的直接接触并削弱细胞毒性活性。TME内复杂的免疫抑制网络进一步加剧了CAR-T细胞的功能障碍，其中包括髓源性抑制细胞（MDSCs）、调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等抑制性细胞组分，这些细胞通过直接细胞间相互作用或分泌免疫抑制性细胞因子（如转化生长因子-β（TGF-β）和白细胞介素-10（IL-10））抑制CAR-T细胞的激活和增殖。同时，TME内的代谢应激（包括缺氧、酸性代谢物积累以及葡萄糖等必需营养物质的耗竭）破坏了CAR-T细胞的代谢稳态并抑制其效应功能。持续的抗原刺激导致免疫抑制性受体（如PD-1和LAG-3）上调，使CAR-T细胞逐渐进入功能性耗竭状态，并伴随记忆T细胞亚群减少，最终丧失持续抗肿瘤活性。此外，实体瘤中抗原表达的异质性使得部分肿瘤细胞亚群可能丢失靶抗原表达，从而逃避CAR-T细胞识别，促进肿瘤抗原逃逸。同时，某些肿瘤靶抗原可能也在正常组织中表达，导致CAR-T细胞在杀伤肿瘤时攻击健康组织，引发靶向肿瘤外毒性（on-target off-tumor toxicity）。这些因素共同使CAR-T细胞在实体瘤中难以实现持久有效的抗肿瘤应答，凸显了通过CRISPR/Cas系统等基因编辑技术优化CAR-T细胞的必要性。

**Overview of gene editing technologies**
自20世纪80年代兴起以来，基因编辑技术逐渐成为生命科学和医学领域不可或缺的工具之一。从20世纪90年代到21世纪10年代，锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的发展取得了重大突破。ZFNs通过工程化锌指蛋白-核酸酶融合构建物实现对特定DNA序列的识别和切割，使精确基因编辑成为可能。TALENs通过将模块化TALE蛋白与FokI内切核酸酶融合，实现对特定DNA序列的精确识别和切割。与ZFNs相比，TALENs具有设计更简单、特异性更高和脱靶效应更低等优势。然而，ZFNs和TALENs仍受限于设计流程复杂、开发周期长以及靶标定制中的技术障碍，这些局限性极大地限制了它们在基础研究和临床转化中的广泛应用。2012年，CRISPR/Cas系统的发现和开发彻底改变了基因编辑领域。由于其高效性、简便性、精确靶向能力以及多重编辑潜力，CRISPR/Cas工具迅速成为主流的基因编辑方法，现广泛用于基因功能筛选、基因和细胞治疗、分子诊断、遗传育种以及生物反应器工程。基于CRISPR/Cas平台，研究人员进一步开发了一系列下一代基因编辑技术。其中，碱基编辑（BE）技术可在不引入DNA双链断裂（DSBs）的情况下实现精确的单核苷酸替换，从而显著降低基因毒性损伤风险，成为纠正遗传性疾病（如镰状细胞病和某些遗传性代谢疾病）点突变的理想策略。2019年，先导编辑（PE）技术被引入，作为一种更通用的基因编辑工具，PE可在不依赖DSBs的情况下介导靶向替换、插入和缺失，具有更好的可控性和更广泛的基因编辑范围，特别适用于修复致病性点突变以及插入和缺失。同时，其他大片段基因组整合策略也在快速发展，为CAR-T细胞工程提供了新的强大技术工具。这些基因编辑技术的迭代进步极大地扩展了可用于CAR-T细胞工程的技术工具箱，并推动了下一代CAR-T细胞疗法的发展。

**Reprogramming CAR-T cells by CRISPR/Cas gene editing**
**Inhibitory receptors**
抑制性受体（IRs）是一类表达于T细胞表面的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族（IgSF）。通过与其相应配体相互作用，这些受体传递抑制信号，限制CAR-T细胞功能，促进耗竭并削弱抗肿瘤应答。在实体瘤的TME中，肿瘤细胞、基质细胞和免疫抑制性免疫细胞常高表达这些配体，导致CAR-T细胞持续暴露于抑制性信号，这很大程度上限制了CAR-T细胞疗法在实体瘤中的疗效。因此，通过基因编辑对IRs进行遗传调控已成为增强CAR-T细胞功能和持久性的有前景策略。已鉴定的IRs中，PD-1是著名的免疫检查点分子，在抑制T细胞功能中发挥重要作用。PD-1在T细胞激活后显著上调，破坏PD-1可使CAR-T细胞抵抗肿瘤内PD-L1介导的抑制，从而改善体内扩增和肿瘤控制。该策略已在多项临床研究中得到评估。一项针对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床研究显示，在PDCD1敲除的抗MUC1 CAR-T细胞治疗的患者中，11例达到疾病稳定（SD），9例出现疾病进展（PD），治疗后观察到症状改善和CAR-T细胞体内扩增。另一项针对间皮素阳性实体瘤患者的临床研究显示，输注PDCD1和TRAC敲除的间皮素特异性CAR-T细胞后，15例患者中2例达到SD，7例在治疗后3-4周达到SD。CTLA-4和BTLA也是特征明确的IRs，在抑制CAR-T细胞功能中发挥重要作用。在含有CD28共刺激结构域的CAR-T细胞中，CTLA-4高表达与T细胞功能障碍密切相关。通过CRISPR/Cas介导的基因编辑，Shi等人证明CTLA-4敲除显著增强了T细胞对结肠癌细胞的体外和体内细胞毒性活性。近年来，BTLA-HVEM信号轴被确定为限制T细胞疗效的关键通路。破坏BTLA显著增强了CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，且无明显毒性。除经典免疫检查点外，其他IRs近年也受到关注。神经纤毛蛋白-1（NRP-1）被证明可维持肿瘤相关Tregs的免疫抑制功能，其阻断可改善抗肿瘤免疫并促进记忆样T细胞表型。Liu等人证明CRISPR介导的NRP-1缺失可增强T细胞的肿瘤浸润和长期抗肿瘤活性。腺苷A2A受体（A2AR）在T细胞中高表达，介导TME中腺苷诱导的免疫抑制。CRISPR/Cas介导的A2AR敲除被报道可显著改善CAR-T细胞对肿瘤的控制，伴随效应细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）分泌增加，并降低对腺苷诱导免疫抑制的敏感性。在原位乳腺癌模型中，A2AR缺陷的CAR-T细胞显著延长了总生存期，在研究终点（输注后第60天）达到80%的生存率，而对照组为0%。值得注意的是，先前用A2AR敲除CAR-T细胞治愈的小鼠完全排斥了后续肿瘤再攻击，表明建立了持久的免疫记忆。此外，CD5（T细胞激活的负调控因子）的基因破坏降低了CAR信号激活阈值，在皮下胰腺癌模型中增强了CAR-T细胞的抗肿瘤活性，将中位总生存期从46天显著延长至102天。由于IR调控网络的复杂性和冗余性，靶向单一IR常不足以完全恢复CAR-T细胞功能，因为平行抑制通路可补偿并继续抑制T细胞活性。为克服这一限制，同时破坏多个IR（如PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4）的多重基因编辑策略被证明更有效。这些组合方法在多项临床前研究中显示出协同效应，显著增强了T细胞浸润、持久性和对实体瘤的细胞毒性活性。

**Transcription factors**
转录因子是控制T细胞命运决定、增殖和免疫功能的关键调控元件。在实体瘤的TME中，持续的抗原刺激、炎症信号和代谢应激可动态重塑转录调控网络，从而影响T细胞分化程序和功能状态。因此，利用CRISPR/Cas基因编辑技术改变关键转录因子以重编程CAR-T细胞，已成为改善实体瘤疗效的重要策略。BATF是AP-1转录因子家族成员，在抗原刺激后上调，随后与IRF4形成转录调控复合物，协同结合AP-1-IRF复合元件（AICEs），从而调控多个靶基因并影响T细胞功能。Zhang等人报道，缺失BATF使CAR-T细胞更抵抗耗竭，并在实体瘤模型中增强其细胞毒性活性。在胰腺癌患者来源异种移植（PDX）模型中，瘤内注射BATF缺陷的CAR-T细胞在80%的小鼠中完全根除了肿瘤。值得注意的是，这种效应仅在耗竭诱导条件下观察到。相反，在非耗竭条件下，BATF过表达在部分病例中增加了抗肿瘤细胞毒性。这些发现强调了关键调控分子依赖情境的作用，并凸显了复杂基因编辑策略的必要性。此外，作者发现CAR-T细胞中IRF4敲除也促进了效应细胞因子释放和肿瘤裂解，但程度低于BATF缺陷。TOX被报道在驱动T细胞耗竭中发挥核心作用。Khan等人证明TOX可通过重塑染色质可及性抑制与效应T细胞（Teff）分化相关的基因持续表达。后续研究进一步证实，TOX部分损伤显著增强了黑色素瘤模型中CAR-T细胞的增殖能力和细胞毒性活性，即使在高肿瘤负荷下也保持了功能性持久性。NR4A家族（NR4A1、NR4A2和NR4A3）是控制T细胞耗竭的另一个关键调控轴。Chen等人报道NR4A高表达与耗竭表型密切相关。通过CRISPR/Cas编辑的基因编辑，Lam等人分别敲除NR4A1、NR4A2或NR4A3，发现单独敲除NR4A3显著增强了抗ROR1 CAR-T细胞的细胞因子产生和细胞毒性。此外，NR4A3敲除与c-Jun过表达的组合在肺癌异种移植模型中产生协同增强的CAR-T细胞抗肿瘤活性。同时敲除NR4A1和NR4A2也被证明可促进TME中TCF1⁺干细胞样祖细胞耗竭T（Tpex）细胞的积累。一致地，进一步研究表明NR4A1/2/3三重敲除策略使CAR-T细胞抵抗耗竭，同时保留记忆特征，从而在体内产生强效抗肿瘤应答。在皮下A549肺腺癌模型中，该方法在输注后第7天即诱导快速肿瘤消退，超过50%的治疗小鼠维持持久肿瘤控制至第40天。在其他研究中，Jung等人表明CAR-T细胞中EGR2敲除减弱了IFN-I驱动的功能障碍，改善了扩增和细胞毒性能力，并增加了早期记忆样T细胞的比例。在皮下前列腺癌异种移植模型中，缺乏EGR2的CAR-T细胞显著抑制了肿瘤生长，所有8只治疗小鼠在输注后第60天均显示有效肿瘤控制。PRDM1编码转录因子BLIMP-1，是终末分化的关键调控因子。持续的PRDM1表达加速了T细胞从效应状态向耗竭状态的转变。Yoshikawa等人证明PRDM1敲除不仅保留了T细胞的早期记忆特征，还恢复了终末分化T细胞中的某些记忆样特征，从而增强了CAR-T细胞的增殖潜力和长期持久性。在皮下A375黑色素瘤模型中，野生型和BLIMP-1缺陷的CAR-T细胞均有效根除了原发肿瘤。然而，在肿瘤再攻击时，缺乏BLIMP-1的CAR-T细胞表现出显著增强的肿瘤控制和优越的体内持久性至第24天，而接受野生型CAR-T细胞的小鼠则显示快速肿瘤进展。

**Kinases**
激酶作为细胞信号网络中的分子开关，在调控T细胞活性中发挥关键作用。其中，负调控激酶可抑制T细胞受体（TCR）和CAR信号，减弱细胞因子应答，并加速耗竭，从而成为限制CAR-T细胞在实体瘤中疗效的主要瓶颈之一。因此，CRISPR/Cas介导的这些抑制性激酶的破坏已成为缓解信号限制和增强CAR-T细胞抗肿瘤疗效的有效策略。IL-2诱导性T细胞激酶（ITK）是TCR信号通路中的关键下游激酶。在慢性抗原刺激下，持续的ITK激活可上调耗竭相关转录因子，加速CAR-T细胞向终末耗竭表型分化，并促进细胞凋亡信号。据Zheng Fu等人报道，ITK敲除不仅降低了耗竭标志物的表达，还增加了记忆相关转录因子的水平，从而增强了CAR-T细胞的持续细胞毒性活性。在慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞系MEC1的皮下异种移植模型中，ITK敲除的CAR-T细胞在输注后第14天实现完全肿瘤消退，并表现出约两倍于对照CAR-T细胞的扩增。造血祖细胞激酶1（HPK1）是由MAP4K1编码的丝氨酸/苏氨酸激酶，作为T细胞信号负调控因子，通过磷酸化SLP-76和GADS，招募抑制性衔接蛋白14-3-3，促进SLP-76-GADS复合物与LAT的解离，导致TCR信号微簇解体，最终传递“停止”信号以微调T细胞免疫应答的幅度。在长期肿瘤抗原刺激下，HPK1还可促进JNK信号并增加TOX表达，驱动PD-1和LAG-3等耗竭标志物的上调。CRISPR/Cas介导的CAR-T细胞中HPK1缺失被报道可增强效应分子（包括颗粒酶B和TNF-α）的分泌，并降低T细胞耗竭程度，从而增强肿瘤清除。在皮下SK-BR-3乳腺癌异种移植模型中，HPK1缺陷的抗HER2 CAR-T细胞显著抑制了肿瘤生长，并将治疗小鼠的生存率提高至输注后第60天的50%，而野生型CAR-T细胞组为0%。二酰基甘油激酶（DGKs）属于参与脂质第二信使代谢的重要激酶家族。在TME中，抑制性信号可增强DGK活性，导致二酰基甘油（DAG）过度消耗，并损害下游转录因子（如NF-κB和AP-1）的激活，从而限制CAR-T细胞激活。CAR-T细胞中DGKA和DGKZ的双重敲除被证明可恢复DAG信号，从而增加细胞因子分泌，改善其他免疫细胞群的招募，并增强对卵巢癌细胞的细胞毒性。在皮下OVCAR-3卵巢癌异种移植模型中，缺乏DGKα或DGKζ的CAR-T细胞比对照CAR-T细胞更有效地抑制了肿瘤生长，但肿瘤在输注后第40-50天左右复发。相比之下，DGKA和DGKZ双重敲除的CAR-T细胞诱导了持久的肿瘤根除，在100天观察期内实现100%的生存率。

**Metabolic regulators**
影响代谢的因子是细胞内稳态和T细胞功能的关键调控因子。它们不仅通过控制能量代谢、脂质合成和氧化还原平衡等基本过程影响T细胞的存活和活性，还通过与信号通路和转录程序的广泛串扰直接参与T细胞激活、增殖和分化的调控。因此，通过CRISPR/Cas介导的基因编辑重塑CAR-T细胞的代谢状态，已成为改善其在实体瘤微环境中代谢适应性、存活和抗肿瘤疗效的有吸引力的策略。Regnase-1是一种多功能RNA结合蛋白，在调控T细胞代谢和功能中发挥关键作用。它通过降解编码促炎细胞因子（如IL-6和IL-12）的mRNA来维持免疫稳态，从而限制过度的细胞因子介导的免疫激活。它还通过降解效应相关mRNA（如IFNG、GZMB）负调控T细胞功能，从而限制T细胞激活、增殖和抗肿瘤活性。相反，抑制Regnase-1可促进长寿命效应T细胞的生成并增强抗肿瘤功能。一致地，观察到干扰T细胞中Regnase-1功能可显著增加效应细胞因子水平，降低耗竭标志物表达，并增强内源性免疫细胞的浸润。Roquin-1由RC3H1基因编码，是一种RNA结合蛋白，在免疫系统中发挥重要作用。它主要作为转录后抑制因子，通过促进特定免疫调节mRNA（如ICOS、TNF、NFKBIZ和IRF4）的降解，抑制过度的T细胞应答和炎症。在富含TGF-β的实体瘤微环境中，Roquin-1通常上调。Roquin-1可结合ICOS mRNA的3'非翻译区（3' UTR），促进其降解或翻译抑制，从而负调控ICOS表达并抑制T细胞激活和效应应答，最终维持免疫稳态并防止过度免疫反应。已证明在皮下AsPC1胰腺癌异种移植模型中，RC3H1敲除的CAR-T细胞与对照细胞相比，在输注后第80天将生存率从0%提高到80%。值得注意的是，Regnase-1和Roquin-1被发现可相互作用形成RNA调控复合物，协同促进炎症mRNA的降解。与此一致，双重敲除策略比任一单独敲除更显著地恢复T细胞功能，通过增强耗竭抵抗、肿瘤浸润和抗肿瘤效力。ACAT1是脂质代谢中一种众所周知的酶，催化游离胆固醇的酯化和储存。通过降低T细胞膜中游离胆固醇水平，ACAT1抑制TCR信号放大并损害免疫突触成熟，从而削弱T细胞激活、增殖和肿瘤杀伤能力。因此，一些研究人员提出了一种靶向ACAT1的策略，通过增强胆固醇依赖性代谢重塑来改善CAR-T细胞抗肿瘤活性。在皮下B16F10黑色素瘤异种移植模型中，接受ACAT1缺失的CAR-T细胞治疗的小鼠比对照CAR-T细胞具有更长的生存期，在输注后第30天生存率从0%提高到50%。

**Epigenetic regulators**
作为关键调控因子，表观遗传调控因子通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等机制塑造基因表达网络，并动态控制T细胞的激活和分化。在实体瘤微环境中，CAR-T细胞的异常表观遗传修饰常驱动T细胞耗竭、损害肿瘤浸润并促进免疫抑制状态，从而成为限制疗效的决定因素之一。通过CRISPR/Cas介导的基因编辑破坏关键表观遗传调控因子可逆转抑制性表观遗传状态并增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能，从而为克服实体瘤治疗中的当前障碍提供有前景的策略。TET2是参与DNA去甲基化的关键酶，它将5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），从而在转录沉默和基因组稳定性中发挥关键作用。在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染期间，TET2驱动干细胞样Tpex细胞向效应样终末耗竭T（Tterm）细胞分化，提示靶向破坏TET2可能通过促进功能持久性增强T细胞活性。值得注意的是，在一项CLL临床研究中，TET2减弱被发现可增强CAR-T细胞的记忆表型，并在一名患者中导致CAR-T细胞的克隆扩增，最终实现长期完全缓解。进一步研究表明，在慢性抗原刺激下，CAR-T细胞中TET2缺陷限制其分化为Tterm细胞，维持或富集具有干细胞/祖细胞特征的细胞群体，并增强增殖能力和代谢适应性，最终改善抗肿瘤疗效。然而，另一项研究表明，双等位基因TET2敲除解除了BATF3-MYC轴的抑制，导致CAR-T细胞发生抗原非依赖性不受控制的增殖和组织浸润，进而引发严重毒性。为解决这一问题，有必要引入安全开关以减轻TET2缺失的CAR-T细胞不受控制增殖的风险，或保留减弱的TET2活性而非完全酶活性消融。例如，Dimitri等人生成了TET2敲除的CAR-T细胞，共表达截短型EGFR，从而在出现严重毒性时可通过西妥昔单抗介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）快速清除。DNMT3A是众所周知的从头DNA甲基转移酶。在慢性抗原刺激下，升高的DNMT3A表达通过甲基化和沉默效应基因（如IFNG和GZMB）以及记忆相关基因（包括IL7R和BCL6）促进T细胞向终末耗竭表型分化。一项研究表明，DNMT3A缺失可使CAR-T细胞维持高增殖潜力，并在实体瘤中更显著地抑制肿瘤进展。在腹腔内骨肉瘤异种移植模型中，DNMT3A缺失的CAR-T细胞表现出持续的抗肿瘤活性，在输注后第150天实现60%的生存率，而对照组为0%。DNMT1是维持性DNA甲基转移酶，在DNA复制过程中甲基化新合成的未甲基化新生DNA链，从而确保基因组DNA甲基化的维持和稳定性。观察到抑制DNMT1可将CAR-T细胞重编程为具有增强抗肿瘤效力的NK样细胞。SUV39H1是一种组蛋白甲基转移酶，特异性催化H3K9三甲基化（H3K9me3），已知通过改变染色质结构和干扰转录因子结合来抑制基因转录。一方面，在CD8⁺ T细胞分化为效应细胞过程中，SUV39H1催化干性相关基因周围的H3K9me3，从而抑制记忆样特性。另一方面，H3K9me3修饰在编码细胞毒性效应分子（如GZMB、PRF1和IFNG）的基因启动子区域也富集，使T细胞保持抑制状态。在CAR-T细胞中，Jain等人发现敲除SUV39H1降低了IRs的表达，增加了记忆相关转录因子的表达，并加速了细胞扩增，从而在反复刺激后促进肿瘤排斥。在转移性前列腺癌模型中，SUV39H1缺陷的CAR-T细胞与对照CAR-T细胞相比显著延长了生存期，在输注后第80天实现60%的生存率，而对照组为0%。另一项研究也表明，SUV39H1缺失通过解除记忆和效应相关基因的表观遗传沉默，诱导T记忆干细胞（Tscm）的形成，从而改善CAR-T细胞的持久性。在静脉注射A549肺癌异种移植模型中，SUV39H1缺失的CAR-T细胞与野生型CAR-T细胞相比显著延长了生存期，在输注后第188天生存率从29%提高到86%。

**Challenges and future perspectives**
**Expanding gene editing technologies**
尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但其在实体瘤中的应用仍面临更大挑战。在此背景下，基因编辑技术通过重编程CAR-T细胞成为克服这些障碍的有前景策略。将CAR盒式结构位点特异性整合到内源基因位点是一种有吸引力的方法。例如，通过将CAR表达置于内源TRAC启动子控制下，Eyquem等人开发了一种有效方法，促进CAR-T细胞的记忆样表型和长期持久性，从而增强肿瘤消除。此外，由CRISPR/Cas9技术生产的非病毒PDCD1整合的抗CD19 CAR-T细胞被证明在治疗复发/难治性侵袭性B-NHL中具有高安全性和有效性。最近一项研究提出了一种策略，可在多个位点同时进行基因编辑，其中将CAR基因敲入TRAC位点，同时将细胞因子敲入NR4A2或RGS16位点，使内源调控元件特异性地在TME中控制细胞因子表达。这种方式克服了基于短DNA调控片段的合成启动子的局限性，并实现了肿瘤限制性局部促炎细胞因子的递送，从而显著提高了传统装甲CAR-T细胞的安全性。除位点特异性整合方法外，碱基编辑进一步扩展了基因编辑技术在工程化CAR-T细胞中的范围。Mu等人设计了一种方法，通过使用胞嘧啶碱基编辑器（CBE）工具在LCK位点引入T316I突变，产生同种异体通用型CAR-T细胞，使其对免疫抑制剂达沙替尼具有抗性，同时破坏TRAC和B2M以避免移植物抗宿主病（GVHD）和免疫排斥。此外，先导编辑通过引入点突变和片段插入，为CAR-T细胞工程提供了多功能平台。例如，先导编辑技术已被用于同时破坏TRAC、B2M和PDCD1，从而生成具有良好临床性能的通用型抗GD2 CAR-T细胞。此外，全基因组CRISPR/Cas筛选已被应用于鉴定负调控T细胞功能的关键基因，以及T细胞存活和活性必需的基因，从而为优化CAR-T细胞治疗实体瘤提供潜在的基因编辑靶点。综上所述，基因编辑技术的持续发展帮助CAR-T细胞应对TME的复杂性。这些多样化的新兴方法涵盖从精确的单一位点基因改变到复杂功能电路的构建，为扩展CAR-T细胞疗法的边界和克服TME障碍提供了多层可调的技术基础，从而推动其走向更高效、可控和可临床转化的未来。

**From multiplex gene editing to combination therapy**
T细胞的状态和免疫功能受高度复杂且相互关联的分子调控网络支配。因此，单基因编辑常不足以完全恢复CAR-T细胞在实体瘤中的活性。相比之下，多重基因编辑策略通过同时调控多个关键基因或添加功能模块，实现对CAR-T细胞的协同工程化，从而更显著地增强CAR-T细胞功能。例如，外源共表达IL-7和IL-15的CAR-T细胞可协同促进向记忆样表型分化并增强细胞增殖，从而显著改善抗肿瘤疗效。CAR-T细胞还可装备分泌功能性分子（如抗PD-L1纳米抗体、CD19-CD3双特异性T细胞接合器以及趋化因子CXCL10、CCL19和CCL21），从而局部重塑TME并招募旁观免疫细胞。此外，一项高通量CRISPR功能筛选研究表明，组合敲除策略（如RHOG、Fas）可在CAR-T细胞中实现转录调控、代谢通路和信号转导的协同优化，以更有效地清除肿瘤。还开发了包含抗HER2 CAR和抗MSLN synNotch电路的双重工程设计，使CAR-T细胞在识别肿瘤抗原时特异性表达基质金属蛋白酶（MMPs）以降解致密ECM，从而增强CAR-T细胞向实体瘤的浸润。实体瘤常表现出“冷肿瘤”表型，特征为免疫细胞浸润差和低炎症活性。致密的纤维化基质、异常血管以及缺氧和酸性代谢条件共同构成了T细胞迁移、存活和效应功能的多重障碍。尽管基因工程策略可部分增强CAR-T细胞对TME中免疫抑制信号的抵抗，但仅靠CAR-T细胞的细胞内修饰可能不足以完全克服TME的各种障碍。因此，将CAR-T细胞与其他旨在将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的疗法相结合的策略，已成为改善CAR-T细胞治疗实体瘤的有前景方向。溶瘤病毒疗法是一种有吸引力的方法。工程化病毒（如AdV@Nap凝胶和T-VEC）在肿瘤细胞内选择性复制并诱导裂解性细胞死亡，同时释放大量损伤相关分子模式（DAMPs），包括HMGB1、ATP和暴露的钙网蛋白。这些分子激活树突状细胞和先天免疫应答，从而放大适应性免疫激活。除直接溶瘤作用外，这些病毒还通过增强抗原呈递和提供局部炎症信号促进CAR-T细胞功能。此外，光动力疗法（PDT）、激光热消融（LTA）和溶瘤肽（OLPs）可在多种肿瘤模型中诱导局部免疫激活，改善TME内的免疫可及性，从而促进CAR-T细胞浸润和效力。此外，癌症疫苗通过增强内源性免疫应答并诱导抗原扩散，已被证明可改善CAR-T细胞的体内扩增和细胞毒性。值得注意的是，早期临床研究显示这些组合疗法有令人鼓舞的初步结果。总体而言，超越单策略细胞工程的整合治疗范式代表了CAR-T细胞治疗实体瘤的有前景未来方向。在此情景下，首先可通过细胞内工程策略（如多重基因编辑）实现CAR-T细胞功能的系统优化，随后与补充性治疗手段（包括溶瘤病毒和癌症疫苗）相结合。除通过内源基因编辑重编程CAR-T细胞外，用外源功能模块武装CAR-T细胞可重塑TME的物理结构、代谢条件和免疫组成，从而与其他疗法一起为实体瘤治疗提供有效策略。随着合成生物学、基因编辑技术和局部免疫调节策略的持续进展，此类组合框架有望显著扩展CAR-T细胞疗法在实体瘤中的潜力。

**Development of predictive models**
除实体瘤固有的生物学限制外，患者间免疫应答的显著异质性是导致CAR-T细胞疗法结果差异的另一个主要因素。接受CAR-T细胞治疗的患者通常先前接受过多轮化疗或处于晚期疾病阶段，生理状况受损。因此，这些患者中T细胞的数量、亚群组成和功能状态严重受损，通常表现为初始或中央记忆T细胞比例降低以及耗竭相关表型表达增加。即使在基线T细胞计数相对正常的患者中，免疫抑制分子（如PD-1和CTLA-4）的表达升高也可能限制CAR-T细胞的体内扩增和长期持久性。因此，基于患者特异性免疫特征建立预测和分层模型，对于实现更精确和个性化的治疗策略、满足不同临床需求以及提高CAR