组蛋白H3K18乳酰化通过免疫检查点淋巴细胞激活基因3介导的小胶质细胞焦亡促进围手术期神经认知障碍

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Histone H3K18 Lactylation Contributes to Perioperative Neurocognitive Disorder Through Immune Checkpoint Lymphocyte Activation Gene 3 Mediated Microglial Pyroptosis

　　

目的：本研究调查组蛋白H3K18乳酰化（H3K18la）是否通过上调免疫检查点淋巴细胞激活基因3（Lag3）和小胶质细胞焦亡，从而加重海马神经炎症，促进围手术期神经认知障碍（PND）。方法：研究人员测定了小鼠手术后海马中的乳酸水平和H3K18la表达。通过CUT&Tag和RNA-seq鉴定了H3K18la的下游靶点。在BV2细胞中沉默Lag3后，通过RNA-seq和体外实验筛选并验证了下游通路。使用糖酵解抑制剂和Lag3抗体评估术后小鼠的认知功能和焦亡相关蛋白表达。结果：手术显著升高了小鼠海马乳酸和H3K18la水平。抑制糖酵解导致H3K18la减少，并减轻了PND模型小鼠的认知损伤。CUT&Tag和RNA-seq揭示H3K18la通过富集于Lag3启动子区域转录激活Lag3，且Lag3阻断改善了术后认知。此外，Lag3上调通过NOD样受体蛋白3（NLRP3）信号触发小胶质细胞焦亡，从而加重神经炎症并促进PND。结论：手术创伤诱导的小胶质细胞H3K18la增加通过上调Lag3并触发NLRP3依赖性小胶质细胞焦亡促进PND，强调H3K18la–Lag3–NLRP3轴作为PND的治疗靶点。

**论文解读：组蛋白H3K18乳酰化通过免疫检查点Lag3介导的小胶质细胞焦亡促进围手术期神经认知障碍**

**研究背景与问题**
围手术期神经认知障碍（PND）是术后常见的中枢神经系统并发症，尤其在老年患者中，表现为记忆减退、注意力不集中、学习能力下降和执行功能障碍，发生率可达10%–54%，严重影响患者预后和生活质量，并增加医疗负担。然而，PND的发病机制尚不明确，缺乏特异性干预手段。已有研究证实，术后神经炎症是PND的关键驱动因素，其中小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在异常激活后释放促炎因子，形成神经炎症恶性循环，导致神经元损伤、突触可塑性受损和神经发生抑制。但小胶质细胞功能障碍的上游信号和表观遗传调控网络仍不清楚。近年来，代谢与表观遗传的交汇为理解神经炎症提供了新视角：术后应激下，小胶质细胞能量代谢从氧化磷酸化（OXPHOS）转向糖酵解，导致乳酸积累，进而驱动组蛋白乳酰化——一种新型乳酸驱动的表观遗传修饰。其中，组蛋白H3K18乳酰化（H3K18la）在神经退行性疾病中通过调节小胶质细胞功能发挥关键作用，但它在PND中的角色尚未阐明。此外，免疫检查点淋巴细胞激活基因3（Lag3）在中枢神经系统小胶质细胞上表达，参与神经炎症调控，但其在PND中的具体机制未知。因此，研究人员开展本研究，旨在揭示H3K18la通过调控Lag3及下游小胶质细胞焦亡在PND发病中的作用，为临床干预提供新靶点。

**研究内容与结论**
研究人员通过小鼠剖腹探查手术模型，结合体外BV2小胶质细胞系，运用CUT&Tag、RNA-seq、Western blotting（WB）、免疫荧光（IF）、行为学测试（旷场实验OFT、新物体识别NOR、巴恩斯迷宫）及糖酵解抑制剂2-DG和抗Lag3单克隆抗体（mAb）干预，系统阐明了H3K18la–Lag3–NLRP3轴在PND中的作用。主要结论：手术创伤诱导海马小胶质细胞中H3K18la升高，通过转录激活Lag3，进而激活NOD样受体蛋白3（NLRP3）信号通路，触发小胶质细胞焦亡，加重神经炎症，最终促进PND发生。糖酵解抑制或Lag3阻断可减轻小胶质细胞焦亡并改善术后认知功能。该研究首次揭示了组蛋白乳酰化在PND中小胶质细胞功能的调控作用，并鉴定出H3K18la–Lag3–NLRP3轴作为PND的潜在治疗靶点，具有重要的科学意义和临床转化价值。论文发表在《CNS Neuroscience》。

**关键技术方法**
研究使用的主要关键技术方法包括：（1）动物模型：雄性C57BL/6小鼠（8–12周龄，购自哈尔滨百清生物技术有限公司）行剖腹探查手术建立PND模型；（2）分子生物学技术：CUT&Tag（靶向H3K18la）结合RNA-seq鉴定下游靶基因，ChIP-qPCR验证H3K18la在Lag3启动子区域的富集；WB和IF检测蛋白表达及细胞共定位；（3）细胞干预：BV2小胶质细胞系（国家细胞资源库）经乳酸、LPS/IFN-γ刺激，以及siRNA沉默Lag3，并使用NLRP3激动剂Nigericin进行回补实验；（4）糖酵解抑制剂2-DG（腹腔注射，250 mg/kg）和抗Lag3 mAb（100 μg，腹腔注射）用于体内干预；（5）行为学评估：OFT排除运动障碍干扰，NOR和巴恩斯迷宫评估认知功能。

**研究结果**
**3.1 手术升高海马乳酸并上调组蛋白Pan-Kla和H3K18la**：通过检测术后不同时间点小鼠海马和血清乳酸水平，发现海马乳酸在术后24 h显著升高并持续至72 h；WB和IF结果显示，海马组蛋白Pan-Kla和H3K18la水平从术后12 h起显著升高，且H3K18la⁺/Iba-1⁺小胶质细胞比例在齿状回（DG）区增加，提示术后小胶质细胞中H3K18la升高可能参与PND发展。
**3.2 糖酵解抑制剂干预缓解术后小鼠认知损伤**：腹腔注射2-DG抑制糖酵解后，NOR实验显示2-DG逆转了手术组对新物体的探索时间减少；巴恩斯迷宫训练和探测试验中，2-DG缩短了手术组的目标距离和逃逸潜伏期，表明降低H3K18la可改善PND模型小鼠认知功能。
**3.3 H3K18la促进免疫检查点基因Lag3的转录**：CUT&Tag分析显示术后小鼠海马H3K18la富集显著增加，共鉴定出25,756个上调结合峰，其中10.99%位于近端启动子区域（≤1 kb）；RNA-seq鉴定出2-DG处理后20个显著下调基因，与CUT&Tag上调靶基因取交集得到6个重叠基因（Asmt、Ccl9、Lag3、Gnb3、H2-Oa、Selplg），其中Lag3的p值最低且为关键免疫检查点；基因组浏览器轨迹和ChIP-qPCR证实H3K18la在Lag3启动子区域富集增加，证明H3K18la转录激活Lag3。
**3.4 术后抑制组蛋白H3K18la抑制小鼠海马小胶质细胞中Lag3表达**：WB显示术后海马Lag3蛋白水平在12–72 h升高，24 h达峰；2-DG干预有效降低Pan-Kla、H3K18la和Lag3表达；IF进一步证实2-DG减少了术后Lag3⁺/Iba-1⁺小胶质细胞数量，体内验证了H3K18la促进Lag3表达。
**3.5 体外实验证实H3K18la促进乳酸或LPS/IFN-γ诱导的小胶质细胞中Lag3表达**：在BV2细胞中，乳酸剂量依赖性地升高Pan-Kla、H3K18la和Lag3；LPS/IFN-γ刺激增加乳酸积累，进一步上调Pan-Kla、H3K18la和Lag3，而2-DG或p300抑制剂A-485可消除此效应，证明乳酸通过H3K18la上调Lag3。
**3.6 抗Lag3单克隆抗体给药改善术后小鼠认知下降**：OFT排除运动差异后，NOR实验显示抗Lag3 mAb组较手术+盐水组显著增加新物体探索时间；巴恩斯迷宫训练和探测试验中，抗Lag3 mAb缩短了逃逸潜伏期和总距离，表明Lag3阻断改善术后空间记忆损伤。
**3.7 BV2细胞RNA-seq揭示Lag3通过NLRP3通路促进小胶质细胞焦亡**：Lag3敲低后RNA-seq鉴定出678个差异基因，其中IL-1β和NLRP3显著下调，富集于炎症反应和NOD样受体信号通路；WB证实Lag3敲低抑制LPS/IFN-γ诱导的NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18表达，并减少LDH释放；NLRP3激动剂Nigericin可恢复Lag3敲低后焦亡相关蛋白的表达，且不改变p-NF-κB水平，表明Lag3通过NF-κB通路上游激活NLRP3依赖性焦亡。
**3.8 抑制糖酵解减轻术后小鼠海马中NLRP3通路介导的小胶质细胞焦亡**：IF显示2-DG减少了术后Caspase-1⁺/Iba-1⁺和GSDMD-N⁺/Iba-1⁺细胞数量；WB证实2-DG降低了NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β表达，表明H3K18la升高诱导术后海马小胶质细胞焦亡。
**3.9 抗Lag3 mAb治疗抑制术后小鼠海马小胶质细胞焦亡**：体内给予抗Lag3 mAb后，IF显示Caspase-1⁺/Iba-1⁺和GSDMD-N⁺/Iba-1⁺细胞减少；WB证实NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表达降低，进一步支持Lag3上调通过NLRP3通路诱导小胶质细胞焦亡促进PND。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次证明手术创伤诱导的海马H3K18la升高通过表观遗传学上调Lag3，激活下游NLRP3通路，加重神经炎症并促进PND。与既往研究一致，H3K18la在阿尔茨海默病（AD）和糖尿病认知障碍模型中促进小胶质细胞介导的神经炎症，但在缺血性卒中中却通过上调plxnb2减轻炎症，这种差异提示H3K18la在不同疾病中调控不同靶基因。Lag3作为免疫检查点，在外周免疫细胞中传递抑制信号，但在中枢神经系统小胶质细胞中，本研究发现其促进焦亡，这可能与术后微环境中的非经典配体结合有关。研究还证实Lag3通过NF-κB信号激活NLRP3炎症小体，驱动小胶质细胞焦亡。局限性包括：未探讨非组蛋白乳酰化、组蛋白乙酰化与乳酰化的交互作用、未区分细胞特异性乳酸来源、未设置仅麻醉对照组，以及仅使用成年雄性小鼠，未来需在老年和雌性动物中验证。结论部分翻译：总之，研究人员阐明手术诱导的小胶质细胞H3K18la升高驱动PND发病。H3K18la上调Lag3触发NLRP3依赖性小胶质细胞焦亡和神经炎症，而Lag3阻断可减轻PND。该研究为PND中小胶质细胞介导的神经炎症提供了新见解，并确定了其治疗中的潜在干预新靶点。