基于干血浆斑点的胶质纤维酸性蛋白定量作为视神经脊髓炎谱系疾病相关生物标志物的评估

《Annals of Clinical and Translational Neurology》：Evaluation of Dried Plasma Spot-Based Quantification of Glial Fibrillary Acidic Protein as a Disease-Associated Biomarker in Neuromyelitis Optica Spectrum Disorder

　　

目的：评估干血浆斑点（DPS）中测量的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与常规血浆和血清GFAP检测在评估水通道蛋白-4免疫球蛋白G阳性视神经脊髓炎谱系疾病（AQP4-IgG⁺ NMOSD）疾病严重程度方面的诊断准确性。方法：纳入来自一个中心的神经免疫前瞻性队列的缓解期样本，包括70名参与者，诊断为AQP4-IgG⁺ NMOSD（n=19）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体相关疾病（MOGAD；n=9）、复发缓解型多发性硬化（RRMS；n=28）和健康对照（HC；n=14）。使用超灵敏的基于邻近连接的方法（核酸连接免疫夹心测定；NULISA）在冻融血浆和配对干血浆斑点（DPS）样本中测量GFAP浓度。在NMOSD中，额外使用单分子阵列（Simoa）测定在配对血清样本中定量GFAP作为参考。评估了跨基质相关性、诊断性能以及与神经功能障碍的关联。结果：通过NULISA测量的GFAP浓度在血浆和DPS样本之间在各诊断组和健康对照中强烈相关。在NMOSD中，通过NULISA测量的血浆GFAP与通过Simoa定量的血清GFAP表现出高度一致性。DPS来源和血浆来源的GFAP对AQP4-IgG⁺ NMOSD显示出良好的诊断准确性，并且与通过扩展残疾状态量表（EDSS）测量的神经功能障碍显著相关。血浆和DPS的组间比较显示，与其他诊断组和健康对照相比，AQP4-IgG⁺ NMOSD中GFAP保持升高。解释：使用NULISA平台在血浆和DPS样本中进行GFAP定量是可行的，并且在可能适合远程的设置中实现了可靠的生物标志物评估。DPS来源的GFAP测量保留了NMOSD中残疾的有意义信息，并可能为未来评估微创毛细管或自我采样方法的研究提供分析框架。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
近年来，血液生物标志物在神经免疫疾病评估中取得显著进展。在多发性硬化（MS）中，血清神经丝轻链（sNfL）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）已被证实具有预后价值。然而，在视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）中，GFAP作为星形细胞损伤的关键标志物，其检测在常规临床中仍受限，尤其在资源匮乏地区。目前，GFAP检测主要依赖静脉穿刺采血，限制了远程或居家监测的可能性。干血浆斑点（DPS）作为一种微创采样技术，已在阿尔茨海默病研究中被用于GFAP定量，但尚未在NMOSD中系统评估。因此，研究人员开展本研究，旨在评估基于DPS的GFAP定量在AQP4-IgG⁺ NMOSD中的诊断准确性、与常规血浆/血清检测的相关性，以及其与疾病严重程度的关系。

**研究内容与结论**
研究人员采用单中心前瞻性队列（Charité-Universit?tsmedizin Berlin的BERLimmun队列），纳入70名参与者，包括AQP4-IgG⁺ NMOSD（n=19）、MOGAD（n=9）、RRMS（n=28）和健康对照（HC，n=14）。使用超灵敏的核酸连接免疫夹心测定（NULISA）平台定量血浆和配对DPS样本中的GFAP浓度，并在NMOSD中额外使用单分子阵列（Simoa）测定血清GFAP作为参考。主要发现：DPS与血浆GFAP浓度呈强相关性（Spearman ρ=0.82），且跨平台（NULISA vs. Simoa）一致性高（r=0.98）。DPS-GFAP对NMOSD的诊断准确性良好（AUC=0.83），且与扩展残疾状态量表（EDSS）评分显著相关（β=1.88，p=0.0019），年龄调整后仍显著。组间比较显示，NMOSD患者的GFAP水平在血浆和DPS中均显著高于其他组。该研究证实，DPS-GFAP保留了诊断和临床相关性，为未来微创毛细管采样在NMOSD中的应用提供了分析框架。论文发表在《Annals of Clinical and Translational Neurology》。

**主要关键技术方法**
本研究使用的主要关键技术包括：1）超灵敏的核酸连接免疫夹心测定（NULISA）平台，用于血浆和DPS样本中GFAP的绝对定量；2）单分子阵列（Simoa）测定（Quanterix平台），作为血清GFAP的参考方法；3）干血浆斑点（DPS）制备与提取流程，包括将冻融血浆涂于滤纸卡、干燥、洗脱并收集洗脱液；4）统计分析，包括Pearson/Spearman相关性分析、受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断准确性、线性回归分析GFAP与EDSS的关联。样本队列来源于德国柏林Charité-Universit?tsmedizin Berlin的单一中心神经免疫前瞻性队列（BERLimmun）。

**研究结果**
**3.1 基线人口学与临床特征**：最终纳入46名参与者（NMOSD n=12，MOGAD n=7，RRMS n=17，HC n=10）。NMOSD患者年龄较大（平均48.9岁），性别分布、BMI、复发时间、EDSS评分在各组间无显著差异，所有患者均在病情稳定期接受免疫治疗（NMOSD和MOGAD均接受抗CD20治疗，RRMS患者接受抗CD20或富马酸二甲酯治疗）。

**3.2 DPS提取**：DPS提取技术可行，但存在边缘效应，约34%的样本（n=24）因提取效率降低需手动回收，这些样本被排除在后续分析之外。最终46个DPS样本用于分析，所有样本检测浓度均在线性范围内。

**3.3 血浆与DPS GFAP值的跨矩阵相关性**：配对分析显示，DPS-GFAP浓度系统性低于血浆（中位差-21.3 pg/mL，p<0.001），但秩次一致性高（Spearman ρ=0.82）。DPS与血浆的中位比值为0.18，线性回归斜率为0.16。平均重复测量结果显示，DPS与血浆GFAP呈强正相关（Pearson r=0.91，p<0.001）。

**3.4 AQP4-IgG⁺ NMOSD中GFAP定量的跨平台相关性**：在NMOSD亚组（n=10）中，血清Simoa GFAP与血浆NULISA GFAP（r=0.98）、DPS NULISA GFAP（r=0.97）均高度相关，血浆与DPS NULISA GFAP也高度相关（r=0.98），表明跨平台和跨基质一致性良好。

**3.5 GFAP在NMOSD中升高（血浆与DPS）**：Kruskal-Wallis检验显示，DPS和血浆GFAP浓度在四组间存在显著差异（DPS: H=21.53, p<0.001；血浆: H=21.87, p<0.001）。NMOSD组的GFAP水平在DPS（p=0.0027 vs. MOGAD, p=0.0032 vs. RRMS, p=0.0019 vs. HC）和血浆（p=0.0023 vs. MOGAD, p=0.0030 vs. RRMS, p<0.001 vs. HC）中均显著高于其他组。ROC分析显示，DPS-GFAP区分NMOSD与其他神经疾病对照的AUC为0.83（灵敏度83.3%，特异性79.4%），区分NMOSD与HC的AUC为0.87（灵敏度83.3%，特异性90.0%）。

**3.6 DPS GFAP与NMOSD临床疾病严重程度的关联**：单变量线性回归显示，DPS-GFAP与EDSS呈正相关（β=1.88 pg/mL/EDSS点，p=0.0019，标准化效应量SES=0.80）。年龄调整后，关联仍显著（β=1.47，p=0.014，SES=0.62）。在MOGAD和RRMS中，未观察到DPS-GFAP与EDSS的显著关联（p>0.1）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，DPS-GFAP测量保留了NMOSD中诊断特异性和残疾相关信息，尽管绝对浓度因提取稀释而降低，但相对差异和秩次关系得以保持。该研究为微创毛细管采样在NMOSD中的应用奠定了基础，尤其适用于资源受限或远程监测场景。然而，研究存在局限性，包括样本量小、年龄组间差异、DPS提取过程中边缘效应导致样本排除，以及所有患者处于稳定期并接受免疫治疗，限制了结论的普适性。未来需进行前瞻性纵向研究，结合毛细管采样和影像学评估，以进一步验证DPS-GFAP在NMOSD中的临床效用。

**研究结论部分翻译**：研究人员的发现表明，使用NULISA AQ可以从DPS样本中定量GFAP，并在NMOSD中保留诊断和临床相关性。基于DPS的GFAP评估代表了NMOSD生物标志物评估的一个有前景策略，其未来潜在应用包括使用微创毛细管血采样进行诊断和疾病监测。在临床实施前，需要进一步的方法学优化和纵向验证（包括使用毛细管来源样本的验证），但该方法可能有助于提高NMOSD及相关星形细胞病中生物标志物评估的可及性和频率。