卵泡周基质细胞通过MDK–NCL信号轴在小鼠与人类中维持卵泡发生

《Cell Discovery》：Perifollicular stromal cells sustain folliculogenesis via MDK–NCL signaling in mice and humans

　　

卵母细胞发育需要颗粒细胞（granulosa cells, GCs）与膜细胞（theca cells）提供协调的代谢与信号支持。研究人员通过对小鼠及人类卵巢进行整合的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与空间转录组分析，发现一类对卵泡发生具有功能特异性的基质亚型。这些具有谷氨酰氨基肽酶（glutamyl aminopeptidase, ENPEP）功能的基质细胞（stromal cells, SCs）因其环绕卵泡的区位被命名为卵泡周基质细胞（perifollicular SCs），具备两项标志特征：（1）从原始卵泡向次级卵泡及窦状卵泡成熟过程中与卵泡发育同步的动态增殖；（2）分泌中期因子（midkine, MDK），激活核仁素（nucleolin, NCL）受体信号以驱动颗粒细胞扩增。进一步卵巢衰老分析揭示，卵泡周基质细胞耗竭与卵泡周基质细胞–颗粒细胞间MDK–NCL信号衰减同时发生。卵泡周基质细胞独特的空间局限性与调控能力使其成为卵泡功能单元的重要组分，为从卵泡微环境视角理解卵巢衰老的分子调控机制提供新理论支撑。

研究背景与立项依据

卵巢由实质与基质双区室构成，每个卵泡作为实质基本功能单元，由卵母细胞及同心排布的体细胞层（颗粒细胞、膜细胞）通过旁分泌/自分泌回路协调扩张。卵泡结构栖居于基质微环境，呈现显著空间分带及动态细胞亚型与区域特异性细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑。尽管卵巢基质在卵泡发育中参与细胞互作，其功能分带与调控机制仍待解析。明确基质特化对理解生殖能力与卵巢早衰等病理至关重要。已有scRNA-seq揭示空间分隔的基质亚型，但局限在于转录组与架构数据整合不足，难以解释局域信号如何协调卵泡成熟。该研究由此切入，旨在绘制产后小鼠卵巢多模态发育图谱，界定卵泡周基质细胞这一新型功能组分及其MDK–NCL信号轴。

论文发表于《Cell Discovery》。研究人员整合五个产后时间点（出生后第3、5、7天及第3、8周，即P3、P5、P7、W3、W8）小鼠卵巢scRNA-seq与三个时间点（P7、W3、W8）10× Visium空间转录组，跨物种比对食蟹猴（GSE130664）及人类（GSE255690）卵巢数据集，并以10月龄小鼠及人青年/老年卵巢作衰老对照，系统回答基质如何分区、如何发信号、如何随龄崩溃。

主要关键技术方法

研究人员采用产后小鼠（C57BL/6J）五个时点卵巢制备单细胞悬液行10× Genomics scRNA-seq，同期卵巢切片行10× Visium空间转录组；跨物种复用已发表食蟹猴（GSE130664）与人（GSE255690）scRNA-seq队列，衰老轴补充10月龄小鼠及人育龄/老年样本；计算端依次用Seurat做聚类注释、Harmony批次校正、Monocle2拟时序、CytoTRACE分化潜能、SCENIC转录因子调控子、CellChat细胞通讯、RCTD空间解卷积与MIA多模态交集；实验端以荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分选ENPEP⁺/ENPEP^?基质细胞，海藻酸盐三维包埋次级卵泡体外培养并外源补MDK或加MDK抑制剂iMDK，结合原位杂交（in situ hybridization, ISH）、免疫组化（immunohistochemistry, IHC）、免疫荧光（immunofluorescence, IF）与多重IF验证空间区位，TUNEL染凋亡。

研究结果

A single-cell map and spatiotemporal dynamics of gene expression during follicle development in the postnatal ovaries of mice

研究人员整合58,319个卵巢细胞分19簇、10系，空间转录组显示内皮–基质–颗粒细胞呈同心层排布；CellChat显示基质细胞在P3、P7、W8通讯强度峰值，且SCs是卵泡微环境生物信号传导最核心发送端，确立SCs为卵泡生态位动态协调者。

Identification and genetic dynamics of ovarian SC subtypes

scRNA-seq将基质解构为8转录簇，CytoTRACE与Monocle2拟时序定位Cluster 6（ENPEP⁺）为低分化起源；ISH/IHC/IF正交验证Ptn、Enpep、STAR、ALDH1A2空间分隔表达，证实基质分子与空间双分层。

SC classification and functional analysis-based pseudotime trajectories

综合定义为四类：结构基质细胞（ECM组织）、卵泡周基质细胞（增殖生态位）、低分化基质细胞（分化潜能）、类固醇生成基质细胞（激素合成）。产后动态显示P7后卵泡周与类固醇生成亚型占比上升。跨物种人卵巢ENPEP⁺ Cluster 1功能同源小鼠卵泡周SCs，富集激酶活性与活性氧代谢，证明哺乳动物基质生态位保守。

Specific regulon networks of ovarian SCs during follicle development

CellChat筛出七条基质主导通路（PTN、MK、非经典WNT、PROS、GAS、ANGPTL、TWEAK），MK信号贯穿全发育窗；配体–受体解析确定Mdk源自SCs、Ncl/Lrp1在GCs接收，人卵巢中GCs也供MDK，ISH印证种属保守性。

Spatiotemporal dynamics of GCs cooperate with SC subtypes to regulate folliculogenesis

颗粒细胞分四亚型（分化cumulus/mural、低分化、增殖、类固醇生成），拟时序从低分化向类固醇生成推进；MK是GCs全程最强入站信号，卵泡周SCs为MDK主要发送端，构成SC–GC旁分泌轴。

Stromal-derived MDK co-culture promotes follicle development

海藻酸盐包埋次级卵泡体外培养，1 mg/L MDK使第6、8天直径显著增大（P=0.0048、0.0086），GCs中Ki67⁺升、Cleaved C3降、FSHR⁺升；10 μM iMDK反向阻断并抑PI3K，第5、8天直径锐减（P<0.01、P<0.0001）。MDK补加组囊胚形态完整性改善，但体外系统本身胚胎潜力受限。

The role of the perifollicular stromal niche in the stage-specific microenvironmental coordination of folliculogenesis

IF定量ENPEP从初级到窦状卵泡逐级上调；FACS分选确认ENPEP⁺成纤维样、高表达Col1a1与Mdk、不表达Foxl2。多重IF示ENPEP⁺细胞居基底膜胶原IV带并与膜细胞CYP17A1层交错；次级卵泡早期ENPEP主导、晚期CYP17A1反超，提示卵泡周SCs可能是膜细胞前体。

Synchronization of dysfunction of perifollicular SCs and folliculogenesis disorders in aging ovaries

10月龄小鼠对比W8显示颗粒细胞减少而基质比例稳，但卵泡周SCs被类固醇生成SCs取代（占老年基质75%）；ANGPTL/GAS/MK通路衰减，ISH示Mdk/Ncl/Lrp1均下调，TUNEL见卵泡周生态位碎裂伴闭锁卵泡。人青年/老年scRNA-seq复述ENPEP下降与MDK–NCL轴保守性衰退。

讨论与结论翻译

研究人员在讨论中指出，卵巢基质不仅是结构支架，更经动态重塑参与生理与病理；本研究将基质生态位解码为结构、卵泡周、低分化、类固醇生成四亚型，其中ENPEP⁺卵泡周SCs以同心层包绕发育卵泡、紧邻膜细胞区，体外可不经激素诱导自发向STAR⁺/CYP17A1⁺类固醇表型分化，挑战经典成纤维细胞起源说，提示其为膜细胞前体。ALDH1A2⁺低分化SCs居皮质与表面上皮下，拟时序居根端，随龄耗竭与卵巢功能消退平行。P7被定为关键分支节点，与Bclaf1调控子失活及HIF-1轴暂抑吻合，可能为“三相细胞模型”启动点。三维海藻酸盐系统复现力学合规区间（100–800 Pa杨氏模量）与空间约束，证SCs可经微机械梯度协调成熟；PCOS中血管增生与ANGPTL4/TWEAK异常与该轴交叉。结论为：卵泡周基质细胞经MDK–NCL信号驱动颗粒细胞扩增、与膜细胞谱系协同、并在卵巢衰老中同步耗竭与信号坍缩，重塑了卵泡功能单元架构，为靶向基质–GC互作治疗生育障碍与卵巢衰老提供框架。