2型糖尿病患者后生元粪便滤液离体损害小鼠肠道肌肉收缩力并体内改变肠胆碱能神经元活性

《Neurogastroenterology & Motility》：Postbiotic Stool Filtrates From Patients With Type 2 Diabetes Impair Mouse Intestinal Muscle Contractility Ex Vivo and Alter Enteric Cholinergic Neuronal Activity in Vivo

　　

摘要
背景：2型糖尿病（T2D）与胃肠功能障碍、肠神经系统损伤及微生物群失调相关。本研究旨在探究糖尿病前期（PD）和T2D患者的滤菌后生元粪便滤液（PSFs）是否离体抑制肌肉收缩，以及T2D PSFs是否体内损害胆碱能肠神经元。方法：将健康小鼠的十二指肠空肠肌层与PD、T2D或健康受试者的PSFs共培养。小鼠PSFs作为对照。将T2D患者或健康受试者的PSFs通过灌胃给予表达GCaMP6f的胆碱能神经元健康小鼠。使用Ca²⁺瞬变幅度评估胃和远端结肠的胆碱能肌间神经元活性，并通过免疫组化测定肌间神经元细胞密度。关键结果：PD和T2D PSFs抑制收缩并导致十二指肠空肠肌层细胞脱落。这些效应可被内毒素结合滤膜逆转，并被蛋白酶抑制剂混合物和加热减轻。T2D患者的PSFs降低胃肠动力，并增加雄性小鼠胃部胆碱能肌间神经元中Ca²⁺瞬变的幅度，但雌性小鼠胃部或两性远端结肠未见此效应。健康受试者的PSFs增加雄性小鼠胃和结肠的神经元密度，该效应在T2D PSFs处理的雄性小鼠及所有雌性小鼠中缺失。结论与推断：这些发现表明，PD和T2D患者PSFs中未鉴定的蛋白酶和其他分子通过抑制肌肉收缩力和诱导胆碱能神经元过度活跃，导致胃肠动力障碍。健康男性受试者的PSFs含有神经营养因子，在T2D中减少。

论文解读文章

**研究背景**
2型糖尿病（T2D）是全球性公共卫生挑战，2024年全球约5.89亿成人患病，预计2050年将达13.1亿。高达75%的T2D患者伴有胃肠功能障碍，如吞咽困难、胃轻瘫、腹痛、便秘和/或腹泻，而糖尿病前期（PD）患者中约96%至少出现一种胃肠紊乱。这些症状常与糖尿病性肠病及肠神经系统（ENS）功能障碍导致的胃肠动力异常直接相关。ENS中的肌间神经丛（MP）包含兴奋性胆碱能神经元和抑制性氮能神经元，二者协同调节蠕动反射。在糖尿病性肠神经病变中，氮能神经元尤其易受损，但胆碱能神经元及其他表型所受影响的研究较少。既往研究提示，高脂饮食（HFD）诱导的肠道微生物群失调（dysbiosis）在T2D相关胃肠动力障碍中发挥重要作用，但后生元液体中生物活性物质的作用尚不明确。研究人员先前发现，HFD小鼠的后生元粪便滤液（PSFs）中含有未鉴定的分子，可触发肠神经病变和动力障碍，但该发现是否适用于人类PD和T2D尚不清楚。本研究旨在确定：（1）PD和T2D患者的PSFs是否离体抑制肠道肌肉收缩力；（2）通过灌胃将T2D患者的PSFs移植到健康小鼠体内是否会降低胃肠动力并损害胆碱能肌间神经元。

**主要关键技术与方法**
研究人员从49名成人（25名男性，24名女性）中收集粪便样本，包括健康对照（HbA1c<5.7%）、PD（HbA1c 5.7%–6.4%）、逆转PD（REV PD，HbA1c<5.7%但既往诊断为PD）和T2D（HbA1c≥6.5%）受试者。采用离体器官型培养：将健康小鼠的十二指肠空肠肌层与不同来源的PSFs共培养，记录收缩频率，并通过显微镜观察细胞损伤。通过蛋白酶抑制剂混合物处理、加热变性及内毒素结合滤膜（Mustang E膜）过滤来鉴定活性分子。体内移植实验：将T2D或健康受试者的PSFs通过灌胃给予8周龄的ChAT-GCaMP6f转基因小鼠（胆碱能神经元表达钙指示蛋白），每周3次，持续8周。通过Evans蓝胃肠转运实验和排便率评估胃肠动力，通过腹腔葡萄糖耐量实验评估糖代谢。利用转盘共聚焦显微镜记录Ca²⁺瞬变幅度以分析胆碱能肌间神经元活性，并通过免疫组化（抗ChAT抗体和ANNA-1抗体）定量神经元密度。

**研究结果**
**3.1 PD和T2D患者的PSFs离体抑制十二指肠空肠肌层收缩**
PSFs来自男性或女性PD、REV PD和T2D患者，在12-24小时后均显著降低健康小鼠十二指肠空肠肌层的收缩频率。男性REV PD患者的PSFs效应弱于PD和T2D患者，而女性各组的效应相似。使用内毒素结合滤膜去除PSFs中的内毒素及其他带负电荷分子后，肌层收缩力得以保持。健康受试者PSFs及脂磷壁酸（LTA）加脂多糖（LPS）混合物未抑制收缩。结论：PD和T2D患者粪便中未鉴定的带负电荷分子（包括内毒素）参与动力障碍。

**3.2 未鉴定的蛋白酶及其他物质介导PSFs的效应**
PSFs来自PD、T2D患者及HFD小鼠（血糖正常）在培养36小时后引起广泛的细胞肿胀和脱落，并几乎完全抑制自发性收缩。广谱蛋白酶抑制剂混合物（PIC）预处理可减轻组织损伤并部分恢复收缩力（约50%），加热变性蛋白酶也减弱了抗收缩效应。健康受试者PSFs及LTA+LPS混合物无此作用。结论：PD和T2D患者粪便中活性蛋白酶水平升高，通过蛋白酶依赖机制损害肌层功能。

**3.3 移植T2D患者PSFs诱导性别特异性体重增加和糖耐量改变，但不影响胃肠转运时间**
与未处理小鼠相比，健康男性PSFs降低雄性小鼠体重增加，而健康女性及T2D女性PSFs均降低雌性小鼠体重增加。T2D男性PSFs诱导雄性小鼠葡萄糖不耐受（曲线下面积增大），而雌性小鼠各组糖耐量无差异。然而，男性和女性T2D患者的PSFs均降低胃肠转运时间（延长）和排便率。结论：T2D PSFs中的分子通过重叠和性别特异性机制影响糖代谢和动力，但动力下降在两种性别中均出现。

**3.4 移植T2D患者PSFs增加雄性小鼠胃部胆碱能神经元活性，而健康受试者PSFs仅增加雄性神经元密度**
在转基因ChAT-GCaMP6f小鼠中，T2D患者PSFs处理的雄性小鼠胃部胆碱能肌间神经元的Ca²⁺瞬变峰值荧光幅度（ΔF）显著高于未处理组和健康PSFs组，而雌性小鼠无显著差异。免疫组化显示，健康男性PSFs增加雄性小鼠胃部所有神经元（ANNA1+）和胆碱能神经元（ChAT+）的密度，而T2D男性PSFs无此效应；女性PSFs对雌性小鼠胃部神经元密度无影响。结论：T2D PSFs含有增强胆碱能神经元活性的分子，而健康男性PSFs含有神经营养因子，该因子在T2D中缺失。

**3.5 T2D患者PSFs移植不改变远端结肠胆碱能神经元活性，但男性受试者PSFs增加神经元密度**
与胃部不同，T2D患者PSFs未改变雄性或雌性小鼠远端结肠胆碱能肌间神经元的Ca²⁺瞬变幅度。健康男性PSFs增加雄性小鼠结肠所有神经元和胆碱能神经元密度，与胃部结果一致，而T2D PSFs及女性PSFs无此效应。结论：T2D PSFs中的调节性分子可能以浓度依赖性方式影响胆碱能神经活性，而非结肠神经元抵抗；性别和T2D影响PSFs中神经营养因子水平。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究证实PD和T2D患者的PSFs中含有未鉴定的蛋白酶及其他带负电荷分子（如内毒素），这些物质通过蛋白酶依赖和非依赖机制离体抑制十二指肠空肠肌层收缩，并导致细胞损伤。体内移植实验表明，T2D PSFs降低两性小鼠胃肠动力，但仅增加雄性小鼠胃部胆碱能神经元活性，提示胆碱能过度活跃可能参与动力异常，但实际动力下降可能是胆碱能过度活跃与氮能神经元损伤协同作用的结果。健康男性PSFs中富含神经营养因子，可增加神经元密度，而T2D PSFs缺乏该效应，可能与产短链脂肪酸菌群减少有关。研究还发现，LTA+LPS混合物不能模拟PSFs的全部效应，提示其他微生物产物（如H₂S、饱和脂肪酸等）也参与其中。局限性包括PSFs成分复杂、灌胃方式非生理性暴露、以及未分析氮能神经元。结论部分翻译如下：结论：本初步研究表明，与健康受试者相比，PD和T2D患者及HFD小鼠中饮食诱导的粪便成分变化导致PSFs中有害分子水平升高，这些分子损害肠神经肌肉装置并破坏胃肠动力。研究结果提示未鉴定的蛋白酶及其他分子是损伤性物质的候选者。尽管受样本量和PSFs复杂性的限制，这些发现强调了饮食诱导的菌群失调驱动的胆碱能过度活跃及神经营养支持缺失可能参与糖尿病性肠病的发病机制。相反，健康男性受试者中富集了促进神经发生或存活的分子。本研究及其他性别差异提示PSFs成分及ENS表型表达的性别差异，以及胃肠生理和病理生理的性别差异。未来研究需鉴定具体分子及其作用机制，包括性别特异性效应。