配对突变检测与空间转录组学鉴定与小鼠结肠炎肿瘤性结局相关的细胞邻域

《Nature Genetics》：Paired mutation calling and spatial transcriptomics identify cellular neighborhoods associated with the neoplastic outcome of mouse colitis

　　

在炎症性肠病（IBD，慢性肠道炎症性疾病）向相关癌症进展的进程中，克隆突变景观从炎症基因突变的选择转变为癌症驱动突变的选择。突变克隆的流行度与扩增如何受其产生环境的细胞环境的影响，以及这些如何影响结肠炎的肿瘤性结局仍未知。本研究结合体内谱系追踪、计算机模拟（in silico modeling）、突变谱分析和空间转录组学（spatial transcriptomics），在结肠炎相关肿瘤发生（CAC，IBD相关的结直肠癌）的小鼠模型中，捕捉与慢性炎症相关的克隆命运。研究人员确定了上皮富集和免疫富集的细胞邻域（cellular neighborhoods），并提出了一个模型：修复性组织环境的建立通过促进促癌性克隆的选择与扩增、减少含非致癌性克隆的炎症抵抗性邻域的范围，从而促进肿瘤起始。

**论文解读：配对突变检测与空间转录组学揭示与小鼠结肠炎肿瘤性结局相关的细胞邻域**

**研究背景与问题**

炎症性肠病（IBD，一种慢性肠道炎症性疾病）影响全球约700万人，并常伴随多种合并症，包括结肠炎相关癌症（CAC，IBD相关的结直肠癌）。既往研究表明，在IBD进展过程中，参与炎症反应的基因（如IL17通路、NF-κB通路及染色质重塑因子Arid1a）的突变在结肠上皮中受到正选择，携带这些突变的克隆表现出更强的存活与扩增能力，被视为对炎症损伤的抵抗性。然而，针对CAC的突变景观分析发现，肿瘤中这些炎症抵抗性突变的流行度显著降低，提示其可能具有抗癌保护作用。这一现象或许解释了为何大多数IBD患者仅在初次诊断十多年后才被确诊为结直肠癌。然而，炎症抵抗性克隆的选择如何受其产生环境的影响，以及这种选择如何影响IBD发病与肿瘤转化之间的平衡，尚不明确，部分原因在于缺乏合适的模型系统。

**研究目标与主要发现**

为了阐明上述问题，研究人员利用Muc2基因敲除（KO）小鼠（Muc2^-/-，即Muc2hom）这一经典慢性结肠炎模型，结合体内谱系追踪、计算机模拟、化学诱变剂（ENU）处理后的靶向扩增测序，以及空间转录组学（10x Genomics Visium平台），对同一组织样本进行配对分析，鉴定与促癌或抗炎突变相关的细胞邻域。研究结果表明，修复性组织环境通过促进隐窝分裂（crypt fission）驱动克隆扩增，并加速促癌克隆（如携带Ctnnb1突变）的扩增；而免疫难治性邻域（immune-refractory neighborhood）则与肿瘤负担负相关，并积累IBD相关突变克隆（如Arid1a失活突变）。该研究发表在《Nature Genetics》上。

**关键技术与方法**

研究人员主要运用了以下关键技术方法：1）体内谱系追踪：使用VillinCreER^t2; Muc2^KO; R26^Confetti小鼠，通过他莫昔芬诱导Cre重组，实现结肠上皮细胞的多色荧光标记，追踪克隆动态。2）计算机模拟：建立二维六角格点模型，模拟隐窝分裂、融合及损伤修复过程中的克隆聚集，量化有效分裂率。3）化学诱变与突变检测：对Muc2^hom小鼠腹腔注射ENU，诱导体细胞突变；对288个2mm直径活检进行22个已知IBD/CAC相关基因（如Trp53、Kras、Smad4、Arid1a等）的靶向扩增测序，利用RePlow算法进行突变检测，并基于Voronoi图划分克隆事件。4）空间转录组学：使用10x Genomics Visium平台对16个组织切片进行空间基因表达谱分析，通过DWLS（dampened weighted least squares，阻尼加权最小二乘法）反卷积、GSVA（gene set variation analysis，基因集变异分析）、Slingshot轨迹推断、SpaceFlow伪时空映射等方法，鉴定和表征细胞邻域。样本队列包括Muc2^hom+ENU小鼠（5只，共16块组织）、DSS+ENU小鼠（6只，模拟化学诱导炎症与肿瘤发生）以及VillinCreER^T; Apc^+/-小鼠（4只，模拟散发性结肠癌），并使用了来自CAC患者的人结肠组织进行验证。

**研究结果**

**Lineage tracing captures increased clonal expansion in colitis**
通过谱系追踪，研究人员在Muc2^hom小鼠结肠的离散区域观察到含有多个隐窝的大型克隆，其平均克隆大小和大克隆数量在7个月时显著高于对照组Muc2^het小鼠，表明炎症持续时间与克隆扩增程度呈正相关。

**Increased crypt fission drives reparative neutral clonal expansion**
计算机模拟显示，组织损伤后修复过程驱动了邻近损伤区域的中性克隆扩增，通过隐窝分裂增加克隆聚集，且这种效应在修复后仍持续存在。

**Tissue repair favors fission-biased clones**
模拟中赋予标记隐窝分裂优势（0.95 vs 0.5）后，修复速度加快，且分裂偏倚克隆在损伤侧和未损伤侧均持续超过野生型克隆，表明修复环境加速了分裂偏倚克隆的扩增。

**Fetal gene expression marks repair-associated crypt fission**
Muc2^hom小鼠结肠转录组分析显示胎儿基因特征（如Trop2）富集，且Trop2表达区域与有效隐窝分裂率呈正相关，确定了修复性上皮区域是克隆扩增的有利环境。

**Identifying cellular neighborhoods in CAC**
对Muc2^hom+ENU小鼠结肠组织进行空间转录组学分析，共鉴定出16个表型聚类，包括上皮富集、免疫富集、肌肉细胞等邻域。其中聚类10被明确鉴定为肿瘤簇，高表达Mmp7和Lyz1，并伴有β-catenin核积累。

**Cell-type composition of cellular neighborhoods**
通过DWLS反卷积，确认主要上皮聚类0-4为上皮富集，其他聚类包含不同比例的免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。聚类11和13分别富集中性粒细胞和B细胞标志物。

**Biological pathways separating epithelial and tumor neighborhoods**
GSVA分析显示，肿瘤簇10富集Wnt信号通路；上皮修复聚类4富集IFN-γ反应和胎儿修复特征；免疫难治性聚类0负富集TGF-β和IFN-α信号，且与肿瘤簇具有转录相似性。

**Evolution of cellular neighborhoods with neoplasia**
基于对称平衡相关性分析，修复聚类4和中性粒细胞富集聚类11与肿瘤簇覆盖率呈正相关，且修复聚类4与聚类11在空间上邻近。免疫难治性聚类0与肿瘤簇呈负相关。SpaceFlow伪时空排序和Slingshot轨迹推断表明，上皮邻域从健康状态（聚类3）分叉为修复谱系（聚类4）和免疫难治谱系（聚类0），其中修复谱系与肿瘤进展高度相关。

**Exploring cellular neighborhoods in alternative tumor models**
在DSS+ENU和Apc^+/-+ENU模型中，部分聚类与Muc2^hom+ENU模型中的邻域匹配，但散发性肿瘤模型中出现独特的CAF（cancer-associated fibroblast，肿瘤相关成纤维细胞）富集邻域，表明不同起始损伤诱导的肿瘤具有不同的基质组成。

**Detection of mutations associated with IBD and CAC**
对288个活检的靶向测序检测到22个基因的SNV，包括CAC驱动基因（Ctnnb1、Kras、Smad4）和IBD相关基因（Arid1a、Il17rc、Pigr等）。dN/dS分析显示Ctnnb1和Apc分别受错义和无义突变的正选择，Ctnnb1突变VAF最高可达27%，与肿瘤中β-catenin核积累相关。

**IBD mutations accumulate outside the tumor neighborhood**
恶性评分显示，Ctnnb1和Smad4的肿瘤关联性最高，而Arid1a、Il17rc等基因的恶性评分低，其突变克隆主要分布在肿瘤外。免疫荧光显示，Arid1a在肿瘤中上调，而在肿瘤外克隆中缺失或下调。Arid1a缺失克隆的比例与免疫难治性聚类0呈正相关，与肿瘤簇和修复簇呈负相关。在CAC患者组织中同样观察到Arid1a缺失克隆位于远离肿瘤的上皮中，而肿瘤中Arid1a上调。

**总结讨论与结论**

讨论部分总结：本研究表明，组织修复通过促进隐窝分裂驱动克隆扩增，并加速促癌克隆（如携带Ctnnb1突变）的扩增；而免疫难治性环境的建立则与肿瘤负担负相关，并积累IBD相关突变克隆（如Arid1a失活突变），这些克隆可能通过竞争抑制促癌克隆的扩增，从而延缓恶性转化。研究结论（翻译）：本研究的发现强调了在IBD长期管理中，促进上皮修复同时限制恶性转化的策略的重要性。调节慢性炎症上皮克隆组成的治疗方法有望降低IBD患者的癌症风险。