应用相同引物联合定量聚合酶链反应与新世代测序技术检测假体周围关节感染的诊断潜力

《Microbiology Spectrum》：The diagnostic potential of combined quantitative polymerase chain reaction and next-generation sequencing using the same primers for periprosthetic joint infection

　　

新世代测序(next-generation sequencing, NGS)能够检测常规培养无法识别的特定病原体，但由于背景污染与结果不可重复，其在骨科领域的应用仍不一致。本研究评估了一种联合广谱16S rRNA基因定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)筛查与下游NGS的新型工作流程的诊断性能，重点关注细菌生物量(biomass)阈值。qPCR检测显示出优异的组内可靠性，组内相关系数(intraclass correlation coefficient, ICC)为0.961（95%置信区间，0.881至0.997）。基于系列稀释阳性对照，确立了105 CFU/mL的定量阈值作为一致检测苛养菌（如大肠杆菌 Escherichia coli）所需的最低浓度。当使用95份超声流体和276份术前/术中组织标本与传统培养进行对比评估时，qPCR检测的灵敏度为80%，特异度为72%。随后对26份临床样本和9份对照进行的NGS测序显示，在6例培养阳性的感染病例中，有4例与NGS分类学结果一致，而其余的差异可能归因于基于培养的表现型误判。值得注意的是，在qPCR阳性病例中，有三例为培养阴性，包括两例表现为多微生物谱的髋关节假体松动病例，以及一例携带低水平葡萄球菌属(Staphylococcus)的创伤后骨关节炎病例。关键的是，该创伤后患者在术后2年发生了迟发性假体周围关节感染(periprosthetic joint infection, PJI)，培养鉴定出的葡萄球菌属(Staphylococcus)与此前初次NGS分析中检测到的菌种一致。整合qPCR筛查与靶向NGS能有效优化病原体鉴定，过滤环境伪影，并克服骨科实践中培养阴性感染的诊断局限性。

研究背景方面，常规诊断检测可能漏诊大量无症状感染患者，这些病例常被误诊为无菌性松动。在临床实践中，当人工关节松动且无典型假体周围关节感染(periprosthetic joint infection, PJI)症状，且无法通过常规培养测试确诊时，会使用下一代测序(next-generation sequencing, NGS)等分子生物学技术诊断感染。然而，NGS在骨科的应用因缺乏定量评估和背景污染问题导致结果不一致，难以区分真正病原体与污染物，尤其在低生物量样本中。2018年肌肉骨骼感染学会(Musculoskeletal Infection Society, MSIS)指南虽提及NGS但缺乏详细定量方案。为填补这一方法学空白，研究人员旨在建立并验证一种实用且高度可重复的假体周围关节感染分子诊断工作流程，利用相同的通用引物进行广谱16S rRNA基因定量聚合酶链反应(quantitative PCR, qPCR)筛查及下游NGS，确定统计学优化的Cq阈值，评估该整合流程相对于传统微生物培养的诊断性能，并展示其在揭示隐匿性亚临床病原体及防止低生物量种植体感染漏诊或误分类中的临床效用。该研究论文发表在《Microbiology Spectrum》。

研究人员开展的关键技术方法主要包括：基于95份连续患者的超声流体样本及276份组织样本的回顾性临床队列评估；使用大肠杆菌(Escherichia coli, ATCC 25922)作为定量阳性对照进行系列稀释（10⁴至10⁷ CFU/mL）以验证qPCR可靠性及确定阈值；采用相同的通用引物（8F与338R）靶向16S rRNA基因V1–V2区分别进行qPCR筛查与NGS扩增；对26份临床样本及9份对照（含阴性对照与模拟群落DNA）进行离子 torrent PGM平台测序；应用QIIME及R包decontam进行生物信息学处理与污染过滤；依据MSIS标准诊断骨科植入物相关感染(orthopedic implant-associated infection, OIAI)并以此作为参考标准计算灵敏度、特异度及Youden指数确定Cq截断值。

研究结果部分保留小标题说明如下：

Reproducibility and reliability of qPCR assays。研究人员通过系列稀释大肠杆菌验证qPCR检测，得出组内相关系数ICC为0.961（95% CI, 0.881–0.997），证实该方法具有极佳的重现性与可靠性，不同浓度下的平均Cq值分别为10⁷ CFU/mL时17.2，10⁶时20.6，10⁵时24.0，10⁴时26.8。

Clinical-based Cq cutoff value obtained from statistical analysis。研究人员基于276份培养结果分析，利用Youden J统计量确定临床Cq截断值为26.4（灵敏度0.773，特异度0.765），对应约10⁴ CFU/mL；但基于稀释实验发现NGS可靠检测需Cq ≤ 25.5（对应10⁵ CFU/mL），故下游分析采用保守阈值Cq ≤ 25.4。

Characteristics of sequencing results near the quantitative limit and determination of the NGS cutoff。研究人员分析序列化稀释阳性对照及阴性对照的NGS结果，发现在10⁴ CFU/mL时肠杆菌科不再占主导（仅占4%读数），而在10⁵ CFU/mL及以上可稳定检测，因此确立Cq 25.5（≤25.4）为NGS可靠鉴定的分析截断值。

Diagnostic performance of qPCR using the NGS-derived cutoff value。研究人员评估显示，应用Cq ≤ 25.4时qPCR灵敏度为80%、特异度为72%；若将任意一次培养阳性或qPCR阳性结合，灵敏度升至95.0%但特异度降至69.4%；若采用严格共识标准（两次培养阳性或一次培养阳性加qPCR阳性），则灵敏度80.0%、特异度100%。

Clinical characteristics and diagnostic outcomes of the NGS cohort。研究人员对15例患者（含26份超声流体）的NGS队列分析显示，6例培养阳性标本中有4例NGS分类学与培养一致；3例qPCR阳性但培养阴性案例中包括两例髋关节松动多微生物谱及一例创伤后骨关节炎低水平葡萄球菌；一例术后2年发生迟发PJI的患者其初始NGS已检出相同葡萄球菌。

Bacterial dominance and potential contaminants in low-biomass samples。研究人员按Cq ≤ 25.4分层发现，低生物量样本中链球菌属(Streptococcus)与切割杆菌属(Cutibacterium)占比异常高，提示其为低生物量条件下的典型背景污染。

Concordance between SFC and NGS for pathogen detection。研究人员对比发现6例培养阳性超声流体中4例NGS检出的优势菌属与培养一致；1例培养检出棒状杆菌属(Corynebacterium)而NGS检出切割杆菌属(Cutibacterium)，推测为培养表型误判。

NGS analysis of qPCR-positive cases with occult infections。研究人员对隐匿感染案例的qPCR阳性样本进行NGS去污染分析，揭示了多微生物谱及低水平病原体（如葡萄球菌属 Staphylococcus），并在一例初期非感染认定的创伤后骨关节炎患者中，证实初次手术NGS检出的葡萄球菌与2年后迟发PJI培养结果一致。

讨论部分总结：研究人员指出qPCR的高重现性（ICC 0.961）是下游NGS质量控制的基础，可过滤低生物量假阳性。ROC曲线下面积AUC为0.820表明qPCR具良好判别力。在低生物量条件下（Cq ≥ 25.5，<10⁵ CFU/mL），NGS图谱趋同于阴性对照背景噪音，链球菌属与切割杆菌属占比增加使真信号难辨，即便使用decontam算法亦无法完全消除试剂来源DNA污染。因此确立Cq截断值对区分目标信号与污染至关重要，临床qPCR诊断阈值（Cq 26.4）与NGS分析检测限存在错位，需联合定量方法保障准确性。培养与NGS一致性分析显示差异可能源于传统表型鉴定局限（如棒状杆菌属与切割杆菌属混淆），NGS可提供序列级精确分类。隐匿感染案例中qPCR阳性联合NGS揭示了培养漏诊的病原体及亚临床定植，提示该分子框架在延迟感染预警中的价值。研究人员承认Cq值存在机构间差异及样本量有限等局限，强调未来需多中心验证。

研究结论部分翻译：总之，本研究支持以下假设：当样本筛选受指定Cq阈值指导时，NGS可在可忽略背景噪音的情况下支持细菌鉴定。在明显感染病例中，基于NGS的鉴定与传统培养显示出高度一致性，同时揭示了传统表型方法固有的潜在分类错误。此外，我们的分子工作流程凸显了NGS解决培养阴性病例中隐匿性感染的能力。然而，由于高通量测序提供的是相对分类学比例而非绝对定量，在低生物量环境中区分可能的致病病原体与环境或试剂污染物仍然具有挑战性。我们的研究结果强调，解读来自低生物量标本的微生态组数据需要格外谨慎，因为计算去污染工具无法完全消除低水平背景伪影。为解决这一技术障碍，我们证明整合qPCR与NGS并应用严格的分析Cq截断值可有效减轻假阳性信号。因此，在利用NGS诊断PJI时，结合定量评估及严格的阴性与阳性对照至关重要。对于测序图谱临界或不确定病例，长期的临床监测仍是明确诊断不可或缺的。最终，需要更大规模的多机构前瞻性研究来完善这些诊断阈值，增强NGS分辨率，并稳固其在骨科实践中的临床应用。