宏基因组比较评估Illumina兼容文库制备方法、短读长及PacBio HiFi测序揭示复杂环境样本中微生物与功能多样性恢复的差异

《Microbiology Spectrum》：Comparative metagenomic assessment of Illumina-compatible library preparation methods, short-read lengths, and PacBio HiFi sequencing reveals differences in microbial and functional diversity recovery from a complex environmental sample

　　

宏基因组学能够全面探索微生物群落，但受文库制备与测序技术影响，进而影响微生物基因组与蛋白质恢复。研究人员利用海洋红树林沉积物与陆地棕榈树土壤组成的复合环境样本，以三重复形式基准测试了六种Illumina兼容短读长文库制备条件（2×150 bp与2×250 bp），并与PacBio HiFi长读长测序并列比较。较长短读长（2×250 bp）结合最优文库制备可改善组装质量、蛋白质检测与MAG恢复，结果接近长读长测序。相同测序读数下，TruSeq文库在2×250 bp较2×150 bp多恢复逾七倍独特蛋白质（811,701对比110,108），恢复高质量MAG数量（11对比18）与PacBio HiFi相近，而蛋白质发现量近十倍超越长读长（811,701对比87,745），成本不足其一半。此外，生物合成基因簇分析在TruSeq-250PE组装中鉴定出46个簇，多于PacBio HiFi的38个，数个在MIBiG数据库中无近匹配。尽管长读长产出更高连续性与完整基因组，较长短读长提供了一种具成本效益、可扩展的替代方案以揭示微生物与功能多样性。这些发现为宏基因组实验设计提供关键指导，表明策略性选择文库制备化学与测序参数可在不增加测序深度下揭示复杂生物群中更多未知微生物信息。

研究背景方面，高通量测序推动生命科学进入基因组发现新时代，宏基因组学通过直接回收环境样本遗传材料，整体刻画微生物群落，绕过分离培养限制，尤其触及未培养“暗物质”。然而宏基因组结果受DNA提取、文库制备、平台、深度与读长显著影响，既有基准多聚焦单试剂盒与固定短读长，缺乏在同一复杂环境样本中联合评估试剂盒化学、读长与DNA投入量的实证。低多样mock群落亦会掩盖协议差异，且土壤等基质中腐殖酸等抑制物增加重复难度。为此，研究人员在沙特KAUST校区采集红树林沉积物与棕榈树土壤，混合池化后用DNeasy PowerMax Soil Kit提取，获得6.2 μg gDNA，以此单一复合样本排除采样与提取变异，系统比较四类Illumina短读长试剂盒（NEBNext Ultra II、Nextera XT、Ovation Ultralow V2、TruSeq DNA Nano，涵盖酶切、转座酶、超声三种片段化化学）在1 ng与/或100 ng投入、2×150 bp（150PE）与2×250 bp（250PE）下的表现，并以PacBio HiFi（SMRTbell Express，2000 ng投入）为长读长参照，共13种测序条件各三重复。

主要关键技术方法上，样本为红树林沉积物与棕榈土壤上层2 cm混合池化gDNA；短读长侧用四种商业试剂盒构建文库后于NovaSeq 6000 SP流动槽行150PE/250PE，长读长侧用SMRTbell Express制备HiFi库于Sequel II行30 h自适应加载；分析流程中短读经BBDuk质控、随机下采样均衡读数、MEGAHIT（--presets meta-large）组装，长读经SMRTlink过滤、hifiasm（meta模式）组装；分类用Kraken2+GTDB207，基因预测用Prodigal（-p meta）经CD-HIT按95%氨基酸一致性去冗余，Diamond比对UniRef90（覆盖≥90%、一致性≥80%）注释；MAG重建用MetaBAT2（最小contig 1500 bp）联合DAS Tool精炼，CheckM估完整性/污染，GTDB-Tk分类，FastANI算相似性，antiSMASH 8.0挖生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs），TYGS行dDDH物种界定。

研究结果部分，DNA分离与文库制备结果显示各试剂盒产率与片段分布各异，TruSeq在250PE有效插入最长（平均223 bp）且PCR重复最低（0.5%），250PE较150PE全试剂盒重复率显著下降。组装指标影响小节指出250PE显著提升N50、contig长度与基因回收，TruSeq-250PE全局合并（global merge，GM）组装每Gb可用数据成本63.4美元，较PacBio HiFi的219.2美元低3.5倍。文库与测序技术影响分类与多样性小节中，属水平PCoA显示试剂盒间β多样性显著（150PE R2=0.617，250PE R2=0.738），Nextera聚类最异，150PE下Nextera差异属与GC含量正相关（Spearman ρ=+0.615），250PE下此相关消失；250PE使NEB属数增2.3倍、TruSeq增4倍，PacBio因深度低显属丰富度最少。蛋白质预测与注释评估小节表明250PE令TruSeq独特蛋白质从110,108跃至811,701，未知蛋白由34,990升至389,567；PacBio虽完整基因比例达96%，但独特蛋白总数仅87,745。MAG小节显示PacBio获18个高质量MAG，GM获16个，KM-TruSeq-250PE获11个；四株潜在新种（g__JABFRZ01、g__VAYN01、未分类Pirellulaceae、g__UBA11591）经TYGS得dDDH均<31%，SRS中KM-TruSeq-250PE还原度最高但contig数279–833对比LRS的1–37，OrthoVenn3显示直同源簇重叠99.1%–99.7%，TruSeq-250PE BGCs 46个多于PacBio 38个。成本效率分析小节中TruSeq-100-250PE每千独特基因1.35美元，PacBio 27.37美元，差20倍；每高质量MAG两者99.8对133.4美元相近。

讨论部分总结，研究人员指出片段化化学（物理超声、酶切、转座）引入可重复偏差，仅靠统一插入长不能解释试剂盒差异，即使将NEB-100截到202–250 bp仍逊TruSeq；超声+大小选择使TruSeq在低重复与均匀聚类占优，酶切引入SNV/indel假象，转座在150PE显GC偏倚而在250PE缓解。读长而非仅深度成为成本效益关键参数，250PE不增读数即提组装连续性。PacBio虽contiguity与完整基因模型优，但对低丰度生物恢复弱、蛋白目录窄、DNA投入与单价高。结论部分译文：据研究人员所知，本研究首次在同一NovaSeq 6000复杂环境样本上直接评估2×150 bp对2×250 bp跨多试剂盒的短读长宏基因组测序，凸显读长可实质影响组装分辨率与MAG重建；复杂样本推荐TruSeq-250PE为黄金组合（需≥100 ng DNA与超声设备），低投入选Ovation-250PE，Nextera XT宜土壤预纯化，NEB适低多样分类筛查，PacBio HiFi仍为连续性参照但扩展性受限；重测既有样本改用250PE即可在不新增采样下继续解码暗物质。该文发表于《Microbiology Spectrum》。